Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Африканская чумы свиней (АЧС) остается одной из самых загадочных и опасных болезней животных. Эффективные вакцины против АЧС отсутствуют, а контроль заболевания возможен только за счет ликвидации всего восприимчивого поголовья и наложения карантина на неблагополучные по данному заболеванию территории. Трудности в разработки вакцин против АЧС связаны с чрезвычайной гетерогенностью вирусного генома, отсутствием данных о протективных антигенах вируса и неизвестной ролью вируснейтрализующих антител в патогенезе болезни. Результаты исследований показывают, что формирование эффективной иммунной защиты против АЧС возможно при использование живых аттенуированных вакцин гомологичного, по отношению к вирулентному штамму, происхождения. Однако, на ряду, с уникальным защитным потенциалом применение аттенуированных вакцин может приводить к значительным неспецифическим реакциям и формированию хронической формы болезни, а также возникновению животных-резервуаров инфекции. Альтернативным подходом в создании средств профилактики АЧС являются ДНК-вакцины на основе структурных белков вируса (Иматдинов А.Р. и др., 2016). Одной из задач, поставленных в рамках выполнения этого проекта, являлось определение генетических локусов вирусной гетерогенности. Другими словами, мы хотели выяснить, что же обуславливает плюраллитет фенотипических признаков и биологических свойств для вируса АЧС разного географического и временного происхождения. Одной из рабочих гипотез проекта было использование феномена гемадсорбции, как фенотипического маркера антигенных различий штаммов вируса АЧС. Ранее было показа, что штаммы вируса АЧС могут проявлять различную активность в реакции гемадсорбции, а также могут быть дифференцированы по иммуногруппам на основе ингибирования гемадсорбции гипреиммунными, в отношении определенного штамма вируса, сыворотками (Середа А.Д., Иматдинов А.Р., Макаров В.В., 2016). Методами функциональной геномики и путем создания рекомбинантных вирусов АЧС был установлен локус CD2v/C-type lectin ответственный за развитие гемадсорбции в инфицированных вирусом АЧС клетках. Филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей CD2v/C-type lectin различных штаммов и изолятов вируса АЧС из Африки, Европы, Латинской Америки и России продемонстрировал полное соответствие генетических кластеров на основе выбранного локуса и иммунотипов вирус по признаку ингибирования гемадсорбции. Полученные данные позволили нам сделать вывод о протективном потенциале выбранного локуса и его доминирующей роли в формировании иммунного ответа против АЧС. С этой целью были созданы рекомбинантные вектора с локусом CD2v/C-type lectin для замены данного фрагмента генома у гетерологичных штаммов вируса. Дополнительно, были созданы делетированные по данному локусу генетические конструкции. Методом гомологичной рекомбинации с использованием модельных вирусов АЧС (Congo-a и France-a) были получены химерные вирусы с измененными фенотипическими свойствами. Изменение локуса CD2v/C-type lectin приводило к изменению взаимодействия вируса и специфической гипериммунной сыворотки определенного серотипа. Удаление CD2v/C-type lectin локуса проявлялось в отсутствие способности инфицированных вирусом АЧС клеток к гемадсорбции. Результаты исследований рекомбинантных вирусов in vitro позволили получить данные о репликативной активности химерных вирусов АЧС, способности к репликации на гетерологичных и гомологичных клеточных линиях, а также определить их основные генетические характеристики. Рекомбинантные штаммы вирусов АЧС депонированы в Государственную коллекцию микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и на них получены патенты на изобретение. Положительные результаты с использованием клеточных линий и рекомбинантных вирусов позволили нам преступить изучению протективного потенциала CD2v/C-type lectin локуса (Burmakina G. et al., 2016) на свиньях. Результаты экспериментов демонстрируют, что CD2v/C-type lectin локус является неотъемлимым компонентом эффективной защиты против АЧС, тем не менее другие серотип-ассоциированные протеины вируса также необходимы для обеспечения иммунного ответа против широко круга изолятов.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Наличие механизмов иммунного уклонения вирусов является ключевым аспектом их успешного развития. Вирус африканской чумы свиней (АЧС) обладает широким арсеналом “орудий” способных максимально эффективно противодействовать иммунной системе хозяина. Именно поиску подходов к “разоружению” вируса АЧС и посвящены исследования в нашем проекте. В отчетном периоде продолжены изучения серотипспецифического локуса (С-type lectin и CD2v) вируса АЧС с использованием рекомбинантных вирусов с измененными (DswCongo/FranceLectinCD2) и делетированным генами (DeltaСongoCD2v). Результаты полногеномного секвенирования показали стабильность трансгена и вирусного генома рекомбинантного вируса (DswCongo/FranceLectinCD2) в течение пассажей на гомологичных и гетерологичных клеточных линиях. Подана заявка на патент DeltaСongoCD2v. Основной объем исследований роли серотипспецифического локуса вируса АЧС были сфокусирован на изучении функциональных особенностей Т-клеточных эпитопов. Результаты проведенных исследований методом ELISpot с использованием пула лейкоцитов от иммунизированных животных и пептидной библиотеки для С-type lectin и CD2v показали наличие иммунодоминантных эпитопов в области C-type Lectin. Данный факт интересен для дальнейшего изучения перекрестного защитного потенциала выбранных эпитопов. Определение роли Т-клеточных эпитопов серотипспецифических антигенов вируса АЧС невозможно без использования экспериментальной модели животных. В отчетный период была проведена серия экспериментов по изучению молекулярного патогенеза аттенуированных и вирулентных штаммов вируса АЧС (Titov et al., 2017). Установлено, что ген B602L является генетическим маркером, который может быть использован для дифференциации близкородственных штаммов вируса. Вирус АЧС способен к длительной персистенции ( до 70 дней) в организме переболевших (иммунизированных) животных, что затрудняет применение аттенуированных вакцин. Дополнительно сконструированы вектора для получения рекомбинантных вирусов АЧС с делетированными иммуномодуляторными участками MGF 505/360. Мимикрия Толл-подобных рецепторов (TLR) является одним из используемых вирусом АЧС способов иммунного уклонения. Изучение иммуномодулирующих белков вируса АЧС являются источником потенциально ценных инструментов для понимания патогенеза заболевания и для создания средств борьбы с болезнью. Для решения этой задачи нами сконструирована стабильная клеточная линия CHO-I329-His, экспрессирующая белок ингибитор TLR-3 пути (Каторкин и др. 2017). Дополнительно показано, что рекомбинантный белок I329L взаимодействовал с гипериммунными сыворотками против штамма «Ставрополь 01/08» вируса АЧС, что свидетельствовало о его аутентичности вирусному белку. Полученная стабильная клеточная линия CHO-I329L-His депонирована в музей клеточных культур ФГБНУ ФИЦВиМ и может быть использована для изучения иммуномодулирующих локусов вируса АЧС.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Ключом к созданию эффективных вакцинных препаратов против АЧС является обнаружение протективных белков в структуре вируса, способных индуцировать гуморальный и клеточный ответ. Мы обнаружили, что серотип-специфические белки вируса АЧС несут Т-клеточные эпитопы и являются неотъемлемой частью эффекторного механизма в борьбе с инфекцией (Burmakina et al., 2018. J.Gen. Virology, 2018). По нашему мнению, серотип-специфические белки должны являться обязательным компонентом вакцины против АЧС, в независимости от ее типа. За прошедший период проекта мы наглядно продемонстрировали, что стратегия ДНК-вакцин не может обеспечить эффективной защиты животных от инфекции вирулентными штаммами. Несмотря на использование нескольких иммунодоминантных белков, а также на существенный Т-клеточный ответ при использовании ДНК-вакцин, животные оставались чувствительны к заражению (Иматдинов и др., 2018) . Сравнительный анализ экспрессии генов аттенуированных и вирулентных штаммов вируса АЧС показал, что на ранних этапах заражения клетки (6-8 часов) доминирующая роль в развитии инфекции принадлежит генам, кодирующим белки участвующие в регуляции синтеза интерферона и противовоспалительных цитокинов. Способность клетки подавлять действие иммуномодулирующих белков вируса играет решающую роль в патогенезе болезни. Искусственная делеция иммуномодулирующих ( факторов вирулентности) белков вируса с использованием методов молекулярной биологии является наиболее перспективным вариантом создания безопасных вакцин против вируса АЧС в краткосрочный период.