Аннотация результатов, полученных в 2015 году
За отчетный период выполнены следующие работы и получены научные результаты: 1. Сконструировано дешевое одноразовое устройство для сбора нелетучих биомаркеров в выдыхаемом воздуха с очисткой вдыхаемого воздуха для предотвращения попадания в пробу аэрозолей из окружающей среды. В отличие от предыдущих прототипов, в новом устройстве аналитический нанофильтр закреплен в держателе и его целостность и герметичность крепления тестируются в условиях лаборатории с использованием специального оборудования, что существенно повышает надежность измерений в условиях клиники. В ИТЭБ РАН изготовлена и оттестирована серия таких приборов для сбора маркеров туберкулеза в выдыхаемом воздухе пациентов ТВ клиники ЦНИИТ РАМН. На основе того же принципа сконструированы устройства для сбора биомаркеров в воздухе, продуваемом через клетки с животными, инфицированными легочной формой туберкулеза. Таким образом, полностью подготовлена техническая база для сбора биомаркеров в выдыхаемом воздухе пациентов с легочной формой туберкулеза и в выдыхаемом воздухе экспериментальных животных. 2. Усовершенствована технология изготовления капроновых фильтров с минимальным количеством материала. Показано, что собранные из воды и воздуха микроорганизмы можно наблюдать на оптически прозрачных нефлуоресцирующих капроновых нанофильтрах методами оптической трансмиссионной и флуоресцентной микроскопии. Установлено, что по высокой степени задержания аэрозольных частиц, малому количеству полимерного материала в фильтре и малому сопротивлению потока воздуха изготовленные нами нанофильтры значительно превосходят коммерческие и опубликованные в литературе аналоги и являются в настоящее время лучшим фильтрующим материалом в мире. Впервые показано, что нанофильтры, изготовленные методом электроформования с газофазной нейтрализацией волокон, обладают селективным пропусканием аэрозольных частиц и частиц суспензии в растворе. Такая селективность указывает на существование калиброванных пор в наноматах, изготовленных по технологии газофазной нейтрализации нановолокон. Предложена теория, объясняющая возникновение таких калиброванных пор в наноматах за счет селективного осаждения заряженных нановолокон на больших порах, которые быстрее нейтрализуются газофазными противоионами. Наличие такого уникального механизма делает наши фильтры лучшим фильтрующим материалом. 3. Экспериментально показано, что белковый материал, высушенный из раствора на фильтре, практически полностью смывается с фильтра буферным раствором даже в отсутствие детергентов и ультразвукового воздействия. Мы полагаем, что наблюдаемая низкая адсорбция белков на фильтре является следствием чрезвычайно малого диаметра нановолокон (менее 20 нм для большинства нитей). При кривизне поверхности нановолокон, сравнимой с кривизной поверхности самих белковых молекул, их адсорбция с разворачиванием на поверхности становится термодинамически невыгодной и потому волокна связывают значительно меньшее количество белка на единицу площади, чем плоская поверхность пленки, изготовленной из того же полимерного материала. 4. Изготовленные нами аналитические нанофильтры были успешно испытаны в туберкулезной клинике Московского Медицинского университета РАМН совместно с проф. М.А Владимирским. Была продемонстрирована чрезвычайно высокая чувствительность определения аэрозольный ДНК микобактерии при использовании для сбора простого аналитического фильтра в виде насадки на бытовой пылесос. После 10-15 минут сбора и определения ДНК методом ПЦР в реальном времени такая процедура позволяет обнаружить 3-4 МТБ генома в кубометре воздуха. Было показано, что в воздухе палат, занимаемых пациентами с активной формой туберкулеза (бактерии в мазках), всегда присутствуют следовые количества геномной ДНК микобактерии. Геномная ДНК также присутствовала на всех поверхностях в этих палатах ( тумбочки, постель, пол) и могла быть собрана с поверхностей бесконтактных методом: сканируя поверхности насадкой на расстояния 5-10 см от поверхности. Полученные данные позволяют предложить простой и дешевый метод контроля распространения инфекции и качества дезинфекции в больницах и в других общественных зданиях. Нанофильтры могут быть использованы для санитарно-эпидемиологического контроля в аэропортах, в транспортных средствах, в контейнерах – всюду, где патогены, токсины или наркотики могут присутствовать в аэрозольной форме или в виде пыли, легко удаляемой с поверхностей. В комбинации с физико-химическими, иммунохимическими, генетическими или инами методами анализа такая технология пробоподготовки может быть использована для обеспечения биобезопасности Российской Федерации. 5. На основе разработанных нанофильтров было сконструировано и изготовлено устройство для сбора аэрозолей в воздухе, прошедшем через клетки с инфицированными мышами. Было установлено что в собранных пробах аэрозолей из воздуха, прошедшего через клетку с мышами, инфицированными легочной формой ТБ, обнаруживается присутствие МБТ ДНК геномных маркеров, что указывает на постоянную эмиссию ДНК микобактерий из клетки с инфицированными мышами. Происхождение этих биомаркеров (из выдыхаемого воздуха или из инфицированной подстилки) предполагается изучить в дальнейших запланированных исследованиях. 6. Фильтры были испытаны как средство сбора нанокапель легочной жидкости в выдыхаемом воздухе с использованием электропроводности как индикатора разбавления легочной жидкости в пробе. С целью увеличения чувствительности была усовершенствована методика изготовления нанофильтров с низким фоновым значением электропроводности смывов и существенно увеличена чувствительность измерения электропроводности с использованием новой измерительной ячейки с расстоянием между плоскими электродами в 50 микрон. Было обнаружено, что образцы, полученные при сборе высушенных микрокапель (с нагревом выдыхаемого воздуха), практически не отличаются от контролей, а образцы, собранные в виде микрокапель при высокой влажности, имеют завышенную электропроводность, что объясняется присутствием значительных количеств аммиака в выдыхаемом воздухе. Таким образом, электропроводность не является адекватным параметром для определения степени разбавления легочной жидкости в собранном материале и следует найти другой индикатор разбавления легочной жидкости в пробе. 7. Разработаны новые подходы для прямого измерения концентрации микрокапель в выдыхаемом воздухе с использованием лазерного счетчика аэрозольных субмикронных частиц (с размерами более 300 нм) и конденсационного счетчика наночастиц в интервале размеров 3-300 нм. С использованием таких методов была охарактеризована индивидуальная вариабельность выхода микрокапель у разных добровольцев, зависимость выхода от влажности, от продолжительности сбора, от типа дыхания и других условий сбора. Установлено, что (1) концентрация микрокапель размером более 300 нм у разных добровольцев варьирует от 2 до 40 в см^3 выдыхаемого воздуха, (2) частицы менее 300 нм присутствуют в выдыхаемом воздухе, но их вклад в общую массу сухого остатка незначителен, (3) концентрация микрокапель снижается в несколько раз при интенсивном дыхании и при задержке дыхания на вдохе, (4) влажность не оказывает заметного эффекта на концентрацию микрокапель в выдыхаемом воздухе, (5) на модели сухого легкого показано, что вероятность выхода микрокапли из легкого зависит от ее размера и составляет около 70 % для капель размеров в 100 нм. Было сконстрировано устройство для сбора твердых остатков высохших микрокапель на поверхности слюды для последующего определения их формы и объема методом атомно-силовой микроскопии. Показано, что средний диаметр сухих остатков составляет 100-150 нм. 8. Из рекомбинантных секретируемых антигенов микобактерии (ESAT-6 и Psts1) и из антител, специфичных к данным антигенам, методом электронапыления были изготовлены микрочипы для обнаружения соответствующих антител и секретируемых антигенов в смывах фильтров после сбора микрокапель и аэрозолей в выдыхаемом воздухе. Молекулы антигенов и антител были химически пришиты к активированной в плазме поверхности мембраны из регенерированной целлюлозы. Тестирование микрочипов с модельными растворами антител и антигенов, с плазмой крови и слюной инфицированых мышей, а также с плазмой крови добровольцев показало, что предел чувствительности определения секретируемых антигенов и антител в пробах объемом 150 мкл составляет 1 фг/мл и 10 фг/мл (10^3-10^4 молекул в пробе), соответственно. Такой уровень чувствительности позволяет быть уверенными, что даже при небольшом количестве собранных из выдыхаемого воздуха на фильтрах антител (по нашим оценкам, 1-10 пг) имеется реальная возможность детекции антител, специфичных к МТБ антигенам. Таким образом, полностью подготовлена база для анализа проб, полученных от больных туберкулезом, с целью выявления МТБ антигенов и антител, специфичных к секретирумым белкам. 9. За отчетный период опубликована 1 статья. Две статьи отосланы в редакции международных журналов.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. Создано одноразовое дешевое устройство для сбора биомаркеров в выдыхаемом воздухе с возможностью его использования для сбора микрокапель, генерируемых при кашле. Устройство было испытано волонтерами в лабораторных условиях. Испытания показали его удобство в пользовании, отсутствие затруднений при дыхании и кашле, отсутствие повреждений фильтров при кашле. После испытаний устройства были переданы в клинику для сбора биомаркеров при кашле и дыхании. Исследование первых проб выявило существенное ухудшение условий для анализа биомаркеров сверх-чувствительным методом: наблюдалось сильное увеличение фона и снижение чувствительности анализа (увеличение предела обнаружения) биомаркеров (иммуноглобулинов, специфичных к секретируемым ТБ антигенам) вследствие неспецифического связывания магнитных частиц с поверхностью микрочипов в присутствии следов мокроты. 2. Создано устройство для сбора биомаркеров в выдыхаемом воздухе мышей при их носовом дыхании, состоящее из системы последовательно соединенных пеналов, насоса и нанофильтра для сбора микрокапель и сухих остатков микрокапель легочной жидкости. В нескольких опытах была продемонстрирована принципиальная возможность определения иммуноглобулинов в пробах выдыхаемого воздуха. В пробах, собранных при дыхании 8 здоровых мышей в течение 5-10 часов были достоверно обнаружены иммуноглобулины класса A. Было показано, что каждая мышь в среднем выдыхает около 6±4 фг иммуноглобулина A за час. Таким образом, продемонстрирована принципиальная возможность обнаружения биомаркеров в выдыхаемом воздухе мышей. 3. С использованием разработанного устройства были собраны пробы выдыхаемого воздуха у мышей с легочной формой туберкулеза. Пробы были собраны и проанализированы на присутствие трех биомаркеров туберкулеза. Присутствие ДНК микобактерий было обнаружено только в одной из 8 собраных проб. В пределах чувствительности ( 0,025 фг/час мышь) не было обнаружено ни секретируемых антигенов микобактерии, ESAT-6 и Psts-1, ни иммуноглобулинов класса A, специфичных к этим антигенам. При этом скорость выдыхания иммуноглобулинов класса A у инфицированных мышей была близка к таковой у здоровых, и составляла 15 ± 10 фг/час мышь. Сделано заключение, что количество выдыхаемых специфичных биомаркеров туберкулеза легких у инфицированных мышей слишком мало для обнаружения. В предыдущем отчете были представлены данные о наличии ДНК микобактерии в пробах, собранных при фильтровании воздуха, прошедшего через клетку с инфицированными мышами. Мы полагаем, что данная ДНК присутствовала в пыли из подстилки и из шерсти животных. 4. Был разработан протокол, регламентирующий процедуру сбора проб из воздуха, выдыхаемого пациентами с легочной формой туберкулеза, и методы подготовки проб для дальнейшего анализа на присутствие биомаркеров инфекции. Особое внимание при разработке протокола уделено биобезопасности при работе с инфекционным материалом. Протокол соответствует этическим стандартам и требованиям к проведению клинических испытаний, согласно Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 года и международным правилам GCP. Протокол утвержден этическим комитетом ФГБНУ ЦНИИТ. 5. С использованием созданного протокола для относительно небольшой когорты пациентов (17 больных) был проведен пилотный анализ на присутствие в собранных пробах ДНК микобактерий, секретируемых антигенов микобактерии, ESAT-6 и Psts-1, и антител к этим секретируемым антигенам. В качестве контрольных образцов были использованы пробы, собранные у 12 здоровых добровольцев. Ни в одной из проб не были обнаружены ДНК маркеры микобактерии и секретируемые антигены микобактерии. Однако, у большинства пациентов в пробах присутствовали иммуноглобулины класса A, специфичные к одному или к обоим секретируемым антигенам. В контрольной группе у небольшого числа здоровых добровольцев также были обнаружены такие специфичные антитела. Из полученных предварительных данных сделаны оценки чувствительности и специфичности метода диагности легочной формы туберкулеза, основанного на использовании фильтров для сбора проб и сверх-чувствительного метода иммунохимического анализа. Чувствительность составила 59- 70%, специфичность 67-75 %. Таким образом, показана принципиальная возможность неинвазивной диагностики больных и людей, контактировавших с выделителями достаточно долго, чтобы выработать антитела к секретируемым антигенам микобактерий. 6. За отчетный период значительно усовершенствован метод иммунохимического анализа. Точность метода была повышена примерно на порядок за счет введения внутренней нормировки и проведения измерений при больших разведениях проб, близких к пределу определения. Был также разработан новый удобный и быстрый метод определения относительных титров специфических антител, не зависящий от вариабельности выхода легочной жидкости в выдыхаемом воздухе у разных пациентов и у одного пациента в разные моменты времени. Собранные пробы воздуха, выдыхаемые пациентами и добровольцами, были проанализированы новым усовершенствованным методом. Были определены титры антител, специфичных к секретируемым антигенам (ESAT-6 и to Psts-1) микобактерии туберкулеза. 7. За отчетный период из печати вышло 4 статьи с указанием на финансирование от РНФ. Общее число статей за 2015-2016 гг составило 5, что соответствует планам проекта. Еще две статьи полностью готовы и находятся в процессе публикации. 8. За отчетный период был предложен принципиально новый подход к неинвазивной диагностике легочных заболеваний по выдыхаемым биомаркерам, в рамках которого предлагается собирать отдельные микрокапли легочной жидкости и определять биомаркеры в каждой из капель. В дополнение к описанному в предыдущем отчете электростатическому коллектору был разработан коллектор инерционного типа и проведены предварительные испытания его эффективности при сборе выдыхаемых микрокапель на поверхность слюды и активированной карбоксиметилцеллюлозы. Удалось показать, что молекулы иммуноглобулинов связываются активированной поверхностью и обнаруживаются магнитными частицами, покрытыми антителами против человеческого IgA. Указанный подход выгодно отличается от всех предложенных ранее тем, что он открывает возможность обнаружения «горячих» микрокапель из инфицированных зон легкого, даже в том случае, если их доля в общей массе собранных микрокапель весьма мала.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. С целью выработки протокола, обепечивающего максимальное количество биомаркеров в выдыхаемых микрокаплях легочной жидкости было исследовано влияние на выход микрокапель предварительного орошения легких различными растворами . Для исследования была создана специальная установка, позволяющая экспонировать мышей аэрозолям растворов при носовом дыхании (nose-only system) и производить измерения концентрации выдыхаемых мышами микрокапель легочной жидкости до и после экспонирования. Орошение производили ультразвуковым небулайзером, генерирующем микрокапли растворов с диаметром 2-7 микрон. Было показано, что 20-минутное орошение водным аэрозолем и аэрозолем солевого раствора (NaCl в концентрации 0.9 %) не приводило к изменению выхода микрокапель. Такое же орошение 1 % раствором поверхностно-активного вещества, Твин-20, при общей дозе в 0.7 мг на мышь, вызывало двукратное снижение выхода микрокапель. С использованием добровольцев были охарактеризованы изменения в концентрации выдыхаемых микрокапель в зависимости от времени суток. Статистически значимых изменений выхода микрокапель с течением времени не обнаружено. 2. С целью выработки протокола, обепечивающего максимальное количество биомаркеров, собираемых при кашле, разработаны методы оценки массы и распределения размеров микрокапель, генерированных при кашле. Массу сухого материала определяли прямым взвешиванием капроновых нанофильтров до и после сбора кашля и с использованием специально сконструированных кварцевых микровесов. По данным измерений первым методом у трех добровольцах при кашле в течении 10 минут было собрано в среднем 8,2+6,6 мг сухой массы. Разработанная нами установка для взвешивания сухих остатков микрокапель на основе подогреваемого кварцевого резонатора и импактора позволила определять собранную массу точностью 1 нг. Измерения на трех добровольцах показали, что общая масса сухих остатков кашля при 10 минутном сборе (10 серий кашля по 1 минуте) вариировала от 2 до 16 нг. Большая разницы в результатах измерений этими двумя методами может объясняться разным временем задержки между эпизодом кашля и сбором, которое для фильтров составляет доли секунды и несколько секунд для кварцевых весов. Прямые оптические измерения собранных микрокапель после окраски в парах иода обнаружили большую вариабельность размеров микрокапель и присутствие больших микрокапель (десятки микрон). Было показано, что ингибирующее влияние мокроты на иммуноанализ антител можно уменьшить, сменив рН буфера, в котором производится электроконцентрирование с рН=8 до рН=6 и изменив направление электрического поля в ячейке при активном иммуноанализе на противоположное. 3. В дополнение к 17 пробам, исследованным в 2016 году, собраны и проанализированы еще 25 проб на присутствие IgA человека и IgA антител, специфичных к секретируемым антигенам микобактерии. У 38 пациентов (90%) в пробах надежно обнаруживались IgA, однако, только у 32 (76%) пациентов их количество превышало 40 фг, уровень, при котором надежно определялись IgA фракции, специфичные к PSTS-1 и/или к ESAT-6. Из 32 образцов, удовлетворяющих такому критерию, антитела к ESAT-6 были обнаружены у 14 (44%), а антитела к PSTS-1 были найдены 22 образцах (69%). Антитела, специфичные к хотя бы одному из указанных антигенов, имелись в 23 (72%) образцах. Общее IgA было обнаружено в 12 из 13 здоровых донаров. В 3-х из этих 12 образцов (25%) здоровых добровольцев были обнаружены антитела, специфичные к ESAT-6, антитела к PSTS-1 или одному из двух этих антигенов обнаружены у 5 доноров (42%). Таким образом, по этим данным чувствительность и специфичность диагностики легочного туберкулеза по наличию антител к секретируемым антигенам микобактерии в выдыхаемом воздухе, составляют 72% и 58%, соответственно. Обнаружена статистически значимая корреляция между наличием антител к ESAT-6 и бактериовыделением. По материалам исследования подготовлена и послана статья в редакцию журнала (Journal of Breath Research). В дополнение к антиген-специфичным антителам был разработан ультра-чувствительный метод определения интерлейкина IL-1beta с пределом обнаружения 10 фг. Из 15 образцов, собранных у больных, IL-1beta был обнаружен только в 4-х. У трех из этих пациентов в пробах также были обнаружены антитела к одному из секретируемых антигенов микробактерии. Ни у одного из 10 здоровых доноров IL-1beta не обнаружен. 4. Исследован в деталях описанный в предыдущем отчете метод сбора микрокапель и сухих остатков с использованием импактора. Была измерена эффективность сбора, и охарактеризована форма капель и сухих остатков, собранных импактором на поверхности стекла, слюды, графита и пленок карбоксиметилцеллюлозы, сшитых обработкой при высокой температуре. Было обнаружено, что эффективность сбора и растекание микрокапель определяется четырьмя факторами: (1) влажностью воздушной смеси, приготовленной из выдыхаемого воздуха и чистого фильтрованного воздуха; (2) температурой смеси, (3) температурой подложки и (4) степенью гидрофильности поверхности. При комнатной температуре воздушной смеси наблюдали разбызгивание микрокапель по поверхности, однако при этом собирали максимальное число микрокапель. Была определена оптимальная температура подложки, которая составляет 30-40 оС. С целью разработки методов иммобилизации биомаркеров на поверхности с использованием атомно-силовой микроскопии было исследовано растекание микрокапель при выдерживании во влажной атмосфере при разных температурах. Было показано, что при повышенной температуре происходит растекание сухих остатков как по гидрофильной (слюда), так и по гидрофобной поверхности (пиролитический графит), причем растекание по последней выявляет симметрию поверхности кристалла графита. Растекание происходит «языками» вдоль осей симметрии базальной плоскости графита. Результаты исследования оформлены в виде статьи, посланной в журнал J. Breath Res.(копия - в приложении). Был разработан специальный алгоритм и создана программа для корреляционного анализа положений (координат) собранных на поверхности микрокапель выдыхаемого воздуха и центров связывания магнитных частиц, покрытых антителами к иммуноглобулину IgA человека. С использованием разработанной программы было исследовано совпадение в положении собранных на поверхности активированной пленки карбоксиметилцеллюлозы микрокапель с центрами специфического связывания магнитных частиц, покрытых антителами против IgA человека. Было продемонстрировано отсутствие преимущественного связывания магнитных частиц в области капель, что свидетельствует о значительном растекании капель, приводящем к равномерному распределению биомаркера (h-IgA) по поверхности. Однако, распределение связанных магнитных частиц хорошо воспроизводилось при смыве частиц и их повторном связывании с той же поверхностью. Вероятность повторного связывания магнитной частицы в окрестности центра связывания в первом изображении в 2-3 раза превышала вероятность случайного связывания в контрольной "пустой" зоне. Такое совпадениев положении свидетельствуето том, что магнитные частицы, покрытые антителами к IgA, связываются специфически с IgA молекулами, иммобилизованными на поверхности пленки. 5. За отчетный период опубликовано 2 статьи в журналах, еще одна принята к печати (доступна в on-line версии) и еще две отправлены в редакцию. Таким образом, общее число статей, принятых и опубликованных за последние три года по теме гранта и с указанием поддержки фондом РНФ составляет 8. Еще две статью, отправленные в редакцию международного журнала, будут опубликованы в следующем году. Цели, основные подходы и достижения данного проекта освещались в средствах массовой информации: http://rscf.ru/ru/node/2289 http://rscf.ru/ru/node/2185 http://serp.mk.ru/articles/2017/01/25/kak-v-pushhino-razvivayut-nanotekhnologii.html http://www.strf.ru/material.aspx?CatalogId=222&d_no=126337