КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-75-10077

НазваниеМолекулярный имиджинг и оптическая томография с эндогенным контрастом: исследование фотофизических процессов и применение для биомедицинской диагностики

РуководительШиршин Евгений Александрович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова", г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ07.2019 - 06.2022

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-602 - Физические методы медицинской диагностики. Томография

Ключевые словамногофотонная томография, кожа, время-разрешенная флуориметрия, меланин, липофусцин, двухфотонное поглощение, окислительный стресс, ИК флуоресценция, биомедицинская диагностика

Код ГРНТИ76.03.29


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Одним из трендов развития биомедицины и биомедицинской диагностики является молекулярный имиджинг, то есть, визуализация процессов в живом организме с использованием сигнала, селективно детектируемого от известного типа молекул. К методам молекулярного имиджинга можно отнести, в частности, МРТ, ПЭТ, КТ (в том числе, однофотонную эмиссионную компьютерную томографию, ОЭКТ), а также ряд оптических методов. В идеале, с помощью молекулярного имиджинга можно отследить локализацию и взаимодействие определенных молекул в организме (например, функционирование фермента в клетках опухоли в ответ на химиотерапию) с целью диагностики заболеваний и разработки лекарств. В большинстве случаев, для реализации молекулярного имиджинга используются экзогенные метки различной природы. Несмотря на то, что глубина проникновения оптического излучения в биологическую ткань значительно меньше, чем для вышеуказанных методов, оптические методы используются для молекулярного имиджинга чрезвычайно широко. Данный факт связан с их высокими пространственным и временным разрешениями, а также с созданием новых типов меток (от генетически кодируемых флуоресцентных белков с эмиссией в различных спектральных диапазонах до всевозможных наночастиц). При этом применение экзогенных меток для неинвазивных исследований на человеке является по ряду причин затруднительным, что обуславливает ориентацию молекулярного имиджинга, в первую очередь, на модельные системы (клеточные культуры и лабораторных животных). В то же время, имеется очевидный запрос на методы неинвазивной диагностики патологических процессов в организме человека на молекулярном и клеточном уровне, поскольку они обладают рядом преимуществ в сравнении с «золотым стандартом» – гистологическими исследованиями. В связи с этим, имеется интерес к методам с эндогенным контрастом, то есть, подходам, в которых информативный сигнал детектируется от молекул, присутствующих в организме: в качестве ярких примеров можно привести гемоглобин как контраст в методе оптоакустической томографии и НАДН в методе флуоресцентной микроскопии. Одним из актуальных методов оптического молекулярного имиджинга, применимым для исследований на человеке in vivo и уже имеющим ряд клинических применений, является многофотонная томография (МФТ) с визуализацией времени затухания флуоресценции (Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM). Основным преимуществом МФТ/FLIM как метода молекулярного имиджинга является высокое пространственное (субмикронное) разрешение в совокупности с большей (в сравнении с конфокальной флуоресцентной микроскопией) глубиной проникновения в ткань (до 1 мм). Наиболее активно (с начала 2000-х годов) МФТ применяется в иммунологии, онкологических исследованиях, нейробиологии, при этом применяются различные экзогенные метки, позволяющие увеличить интенсивность сигнала, его специфичность и глубину имиджинга, и, в то же время, лимитирующие in vivo применения метода. В ряде работ показано, что использование только эндогенного сигнала позволяет не только визуализировать распределение молекул определенного типа в ткани с использованием МФТ, но и исследовать протекающие в ней биохимические процессы. Научные задачи данного проекта стимулированы тем фактом, что на данный момент в МФТ используется лишь сигнал от ограниченного количества флуорофоров: так, в их число входят НАД(Ф)Н и ФАД (что лежит в основе метаболического имиджинга), меланин, коллаген, эластин и кератин. При этом имеются широкие перспективы для расширения возможностей МФТ, для чего необходимо проведение комплексного исследования, затрагивающего вопросы формирования сигнала при оптической томографии и фотофизических механизмов, ответственных за оптический отклик эндогенных флуорофоров, а также разработка методов селекции сигналов от эндогенных молекул-репортеров и верификация их применимости для биомедицинской диагностики. Данный проект посвящен развитию пяти новых направлений в флуоресцентном молекулярном имиджинге и оптической томографии, основанных на особенностях фотофизических процессов при многофотонном и однофотонном возбуждении флуорофоров, а также на особенностях механизмов формирования их оптических свойств: 1. Селективной визуализации пигментов с гетерогенной структурой – меланина, липофусцина, а также флуоресцентных продуктов гликирования. 2. Локализации сигнала от окисленных белков и продуктов окисления липидов в клетках эпидермиса и в соединительной ткани. 3. Разработке методов определения абсолютных концентраций флуорофоров с использованием нелинейных процессов. 4. Исследованию образования фотопродуктов при многофотонной томографии и возможности использования их сигнала для визуализации биохимических процессов. 5. Визуализации процессов с участием макрофагов при воспалительных процессах и заживлении ран с использованием специфичного сигнала флуоресценции, связанного с фагоцитозом. Указанное направление является новым, и в случае успешного решения указанных задач будут значительно расширены возможности оптической томографии и молекулярного имиджинга в диагностике диабета (окисленные и гликированные белки), меланомы (определение локализации различных типов меланина), исследовании процессов окислительного стресса и старения, а также регенеративных процессов. При этом на основе фундаментальных исследований, выполненных с использованием МФТ, будут разрабатываться подходы к биомедицинской диагностики части вышеуказанных процессов с использованием более простых и дешевых методов флуоресцентной спектроскопии, в том числе, с использованием эндогенной флуоресценции в ИК области спектра.

Ожидаемые результаты
Глобальным результатом проекта будет являться решение пяти задач: 1. Разработки методов селективной визуализации пигментов с гетерогенной структурой – меланина, липофусцина, а также флуоресцентных продуктов гликирования. 2. Разработки методов локализации сигнала от окисленных белков и продуктов окисления липидов в клетках эпидермиса и в соединительной ткани. 3. Разработки методов определения абсолютных концентраций флуорофоров с использованием нелинейных процессов. 4. Разработки моделей образования фотопродуктов при многофотонной томографии и разработки методов для визуализации биохимических процессов с использованием сигнала фотопродуктов. 5. Разработки метода визуализации процессов с участием макрофагов при воспалительных процессах и заживлении ран с использованием специфичного сигнала флуоресценции, связанного с фагоцитозом. В результате решения указанных задач ожидаются следующие результаты: - Будет разработана методика измерения фотофизических параметров гетерогенных систем (сечения возбуждения флуоресценции и квантового выхода флуоресценции) - Будет проведено комплексное исследование фотофизических процессов в гетерогенных системах флуорофоров: определены количественно параметры одно- и многофотонного возбуждения и эмиссии флуоресценции, квантового выхода флуоресценции и его зависимости от длины волны эмиссии, сечений двухфотонного поглощения, времен жизни флуоресценции и т.д. Объектами исследования будут являться: синтетический меланин, полученный, в частности, окислением DOPA; липофусцин, продукты гликирования глобулярных и фибриллярных белков. - Будет проведено исследование параметров ИК-флуоресценции гетерогенных систем флуорофоров (пигментов) и разработан метод диагностики процессов гликирования и окислительного стресса в коже. - Будут разработаны модели формирования оптического отклика при флуоресцентной томографии с использованием ИК-флуоресценции эндогенных пигментов. - Будет проведено комплексное исследование фотофизических процессов в продуктах окисления белков и разработан метод их детектирования в клетках при окислительном стрессе. - Будет разработан метод на основе МФТ для детектирования различных типов меланина in vivo. - Будет разработан метод определения концентрации флуорофоров с использованием нелинейной флуориметрии при реализации МФТ. - Будут разработаны алгоритмы локализации флуорофоров различного типа на 3D изображениях, полученных с помощью системы IVIS, с помощью методов кластеризации спектральных данных. - Будут исследованы фотохимические процессов при МФТ и их влияние на оптический отклик клеток и тканей - Будет проведено комплексное исследование формирования оптического отклика клеток эпидермиса: количественный анализ вкладов кератина, НАД(Ф)Н, ФАД, окисленных белков, липидов, липофусцина и меланина, а также разработан метод разделения сигналов флуорофоров с использованием FLIM со спектральным разрешением. - Будет разработана методика выделения сигнала от продуктов окисления в клетках и образцах кожи ex vivo, верификация данного подхода с использованием независимых методов. - Будет разработан метод исследование накопления продуктов гликирования в различных структурах в коже in vivo, а также проведено исследование корреляции параметров клеток эпидермиса, полученных методом флуоресцентного метаболического имиджинга, с параметрами продуктов гликирования. - Будут разработаны методы селективного детектирования липофусцина in vivo с использованием МФТ, изучена корреляция параметров клеток эпидермиса, полученных методом флуоресцентного метаболического имиджинга, с параметрами липофусцина и окисленных белков для здоровых добровольцев и больных диабетом и сердечной недостаточностью (при которой должен наблюдаться окислительный стресс). Будет разработан комплексного метода анализа окислительного стресса на молекулярном уровне in vivo. - Будут исследованы оптические характеристики клеток в дерме ex vivo и in vivo, а также разработан метод селективного выделения сигнала от клеток в дерме in vivo c использованием МФТ - Будет разработан метод анализа процессов с участием макрофагов (фагоцитоза и, прежде всего, эритрофагоцитоза) с использованием флуоресцентной спектроскопии как на основе метода МФТ, так и на основе однофотонной флуоресцентной томографии в ИК области спектра.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Одним из трендов развития биомедицины и биомедицинской диагностики является молекулярный имиджинг, то есть, визуализация процессов в живом организме с использованием сигнала, селективно детектируемого от известного типа молекул. К методам молекулярного имиджинга можно отнести и ряд оптических методов. В идеале, с помощью молекулярного имиджинга можно отследить локализацию и взаимодействие определенных молекул в организме с целью диагностики заболеваний и разработки лекарств. В большинстве случаев, для реализации молекулярного имиджинга используются экзогенные метки различной природы. Несмотря на то, что глубина проникновения оптического излучения в биологическую ткань невелика, оптические методы используются для молекулярного имиджинга чрезвычайно широко. Это связано во много с интересом к методам неинвазивной диагностики патологических процессов в организме человека на молекулярном и клеточном уровне, поскольку они обладают рядом преимуществ в сравнении с «золотым стандартом» – гистологическими исследованиями. В связи с этим, имеется интерес к методам с эндогенным контрастом, то есть, подходам, в которых информативный сигнал детектируется от молекул, присутствующих в организме. Задачи данного проекта были стимулированы тем фактом, что во-первых, список эндогенных молекул, которые могут выступать в качестве контраста для молекулярного имиджинга, достаточно ограничен, а, во-вторых, ряд структур и процессов в организме до сих пор не был визуализирован и изучен с помощью эндогенного (флуоресцентного) контраста. Таким образом, для расширения возможностей методов оптической спектроскопии (флуоресцентной и спектроскопии комбинационного рассеяния) и микроскопии (прежде всего, многофотонной томографии, МФТ) необходимо проведение комплексного исследования, затрагивающего вопросы формирования сигнала при оптической томографии и фотофизических механизмов, ответственных за оптический отклик эндогенных флуорофоров, а также разработка методов селекции сигналов от эндогенных молекул-репортеров и верификация их применимости для биомедицинской диагностики. В результате, работа в проекте шла по двум направлениям: (1) исследование новых типов флуорофоров, механизмов формирования оптических свойств в них и возможностей их применения в диагностике и (2) применение методов оптической спектроскопии и микроскопии для детектирования объектов, исследование которых неинвазивно на пациентах ранее было затруднено. Наиболее важными из полученных на отчетном этапе результатов являются: 1) описание механизмов формирования оптических свойств молекул при их окислении, 2) влияние окислительных процессов на оптические свойства клеток (in vitro), 3) определение локализации и свойств меланина и продуктов окисления in vivo с помощью одновременного применения флуоресцентной спектроскопии и микроскопии КР, 4) детектирование тучных клеток в дерме методом МФТ/FLIM. 1. Было исследовано формирование оптического отклика систем, возникающих в результате окисления молекул-прекурсоров. Было показано, что при окислении аминокислот, белков, прекурсоров меланина возникает монотонно спадающее с ростом длины волны поглощение в видимом и ближнем ИК диапазоне. При окислении также возникает флуоресцентный отклик в видимом и ИК диапазоне, параметры которого (положение максимума и квантовый выход) зависят от длины волны возбуждения. Было получено, что для гетерогенных систем, образованных в результате окисления, стоксов сдвиг и квантовый выход монотонно спадают с ростом длины волны возбуждения. Методом сверхбыстрой спектроскопии был показан перенос энергии возбуждения в таких системах и наличие в них спектральной диффузии. В результате была предложена модель формирования оптических свойств в гетерогенных системах флуорофоров, образующихся в результате окисления биомолекул, объясняющая, в частности, закономерности формирования низкого квантового выхода флуоресценции и широкого спектра возбуждения. 2. Роль продуктов окисления в формировании оптического сигнала в красной и ИК области спектра была продемонстрирована также на примере клеточной культуры. Было показано, что продукты окисления аминокислот, белков, ДНК, липидов – а их могут быть сотни – причастны к формированию флуоресцентного отклика от клеток в красном и ИК диапазонах. Было показано, что, несмотря на гетерогенность молекулярного состава, электронное взаимодействие между продуктами окисления приводит к оптическому отклику со свойствами, не зависящими от наличия конкретного флуорофора. Иными словами, первичен механизм взаимодействия между молекулами-продуктами окисления, а не наличие конкретного вещества. Понимание этого механизма позволяет отслеживать состояние живых клеток, например, детектировать в них окислительный стресс, а также проводить диагностику патологических процессов в организме человека in vivo, используя красную и ИК флуоресценцию, например, для исследования воспалительных и онкологических процессов. 3. В качестве продолжения направления, связанного с влиянием окислительных процессов на оптические свойства клеток и тканей, была проведена серия экспериментов по облучению кожи УФ излучением in vivo и ex vivo несколькими методами, включая МФТ. Было показано, что в случае образцов ex vivo наблюдалось быстрое увеличение ИК флуоресценции для УФ-облученных образцов, что соответствовало результатам, полученным на клетках и модельных образцах (растворах). На основе спектроскопии комбинационного рассеяния и флуоресцентной спектроскопии был предложен новый подход к определению локализации и свойств меланина in vivo, а также продуктов окисления белков, ответственных за ИК флуоресценцию кожи. 4. На основе метода МФТ/FLIM был разработан метод для исследования клеток в дерме, в частности, тучных клеток. Несмотря на то, что МФТ позволяет исследовать структуры в коже на глубине до ~150 мкм с субмикронным разрешением, в литературе отсутствует описание применения этого метода для визуализации и диагностики ряда компонентов кожи, которые должны наблюдаться в исследуемом объеме. В частности, нам неизвестны работы, в которых бы сообщалось об исследовании клеток в дерме человека in vivo методом МФТ. Под клетками в дерме при этом мы понимаем, в частности, фибробласты, макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки и др. ТК являются многофункциональными клетками иммунной системы. Они непосредственно участвуют в этиологии нескольких заболеваний, включая крапивницу, псориаз, атопический дерматит и мастоцитоз, при которых их концентрация увеличиваются в местах поражения. Рутинным методом для оценки числа ТК и их состояния (наличия активации) служит гистоморфометрическое исследование биопсийных образцов, в то время как неинвазивных методов для исследования ТК in vivo у пациентов не существует. В рамках данного проекта нами был предложен алгоритм для in vivo детектирования тучных клеток методом МФТ/FLIM, который был верифицирован с помощью гистологических исследований.

 

Публикации

1. Семенов А.Н., Якимов Б.П., Рубекина А.А., Горин Д.А., Драче В.П., Зарубин М.П., Великанов А.Н., Ладеманн Ю., Фадеев В.В., Приезжев А.В., Дарвин М.Е., Ширшин Е.А. The Oxidation-Induced Autofluorescence Hypothesis: Red Edge Excitation and Implications for Metabolic Imaging Molecules, - (год публикации - 2020).