Аннотация результатов, полученных в 2015 году
На первом этапе работы над проектом планировалось создать интрон-содержащие репортерные векторы на основе флюоресцентных белков, которые будут использоваться для скрининга библиотеки нокаутов GeCKO в тесте межклеточной инфекции ВИЧ-1. Ранее, путем оптимизации сайта для вставки интрона в гены gfp-turbo и mcherry были созданы векторы с уровнем сплайсинга около 30-50%. Для дальнейшего усовершенствования векторов мы предложили ввести в интрон различные cis-элементы, которые препятствуют экспорту из ядра несплайсированной РНК или ингибируют упаковку репортерной РНК с интроном в вирусные частицы. Однако ни один из этих подходов не имел успеха. Тогда мы решили, что можно усилить деградацию несплайсированной РНК репортера в цитоплазме по механизму РНК-интерференции. Для этого были протестированы несколько вариантов shRNAs, направленных против интрона. Как в случае экспрессии in trans, так и при экспрессии in cis (т.е. при клонировании shRNA в репортерный вектор HIV-inGFPt) экспрессия репортерного белка увеличивалась в несколько раз. Наиболее оптимальная модификация интрона последовательностью shRNA, которая фланкирована miR30 и направлена на интрон в положении 330, была переклонирована в вирусные векторы на основе других репортерных генов – mCherry, luc и rfp. Во всех случаях экспрессия репортера и уровень его сплайсинга были существенно улучшены. Таким образом, были получены новые векторы inGFPt и inmCherry с уровнем спайсинга 70-80%. Используя данную пару векторов и проточную цитометрию, мы показали возможность не только количественно измерять уровень межклеточной инфекции ВИЧ в лимфоидных клетках, но и оценивать множественность инфекции. Так, было продемонстрировано, что количество клеток-мишеней, инфицированных двумя и более вирусами, возрастает в 3 раза в условиях межклеточной инфекции в сравнении с инфекцией свободным вирусом. Данный эффект исчезает, если поверхностный белок Env ВИЧ-1 заменить на Env из вируса везикулярного стоматита (VSV), что указывает на то, что Env ВИЧ-1 необходим для формирования вирусологического синапса и запуска механизма межклеточной трансмиссии вируса. Результаты данной работы опубликованы в статье Shunaeva et al. J Virol. 2015 Oct 15;89(20):10591-601. Заражение клетки несколькими вирусами является основой для формирования рекомбинантных форм ВИЧ-1 и приобретения новой устойчивости вируса к лекарствам и иммунному ответу. Несмотря на то, что данная работа была сделана с векторами на основе субрипа B ВИЧ-1, нами было показано, что субтип А ВИЧ-1, циркулирующий в России, рекомбинирует в не меньшей степени, чем субтип В (Nikolaitchik et al., Virology 2015 Oct;484:334-40). В рамках работы над проектом мы также отработали метод нокаутирования ряда генов, экспрессирующихся на Т-клетках человека, с помощью никазного мутанта Cas9D10A и пары гидовых РНК (gRNA). Были отработаны принципы подбора gRNAs, времени фенотипического проявления нокаута и методы селекции нокаутных клеток, результаты которых частично вошли в наши публикации Tarasevich et al., Acta Virol. 2015 Sep;59(3):247-56 и Filatov et al., Clinical & Translational Immunology 2015, doi 10.1038/cti.2015.22.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В ходе реализации проекта получены упаковочные векторы ВИЧ-1 с мутациями в акцессорных генах Vif, Vpr, Vpu и Nef, которые полностью инактивируют их экспрессию, что показано методом Вестерн-блота на трансфецированных клетках HEK 293T. Продукция вирусных частиц ВИЧ-1, дефектного по каждому из акцессорных генов, была несколько снижена (в 1.5-2 раза) по сравнению с вирусом дикого типа, что согласуется с данными других исследователей. Уровни репликации ВИЧ-1, дефектного по акцессорным генам, были измерены с помощью ранее разработанного нами интрон-регулируемого вектора inLuc на клетках HEK 293T и Jurkat-to-Raji/CD4 клеточной системе в тестах межклеточной инфекции и инфекции свободным вирусом. Показано, что в нелимфоидных клетках HEK 293T мутация в любом из акцессорных генов не влияла существенно на уровень инфекции в этих клетках. В противоположность этому, межклеточная инфекция в системе Jurkat-to-Raji/CD4 повышалась в 5 раз при инактивации Vpu и снижалась в 2 и 1.5 раза в отсутствии Vpr и Nef соответственно. Совершенно другие результаты были получены при измерении инфекции клеток Raji/CD4 свободным вирусом, полученным от трансфецированных клеток Jurkat. В этих условия репликация ВИЧ-1 снижалась в 1.5-2 раза, когда не экспрессировался Vpr или Vpu, и уменьшалась в 7 или 20 раз при инактивации Vif и Nef соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия факторов рестрикции, механизмы передачи вируса и тип Env играют определяющую роль в действии акцессорных белков ВИЧ-1 на его репликацию. Данные позволят выбрать наиболее эффективную стратегию скрининга библиотеки нокаутов GeCKO в целях поиска новых рестрикционных факторов ВИЧ. На этом же этапе мы получили клеточные линии CEM и Raji/CD4 с библиотекой нокаутов GeCKO. Предварительная оценка качества приготовленных клеток с библиотекой позволяет, по крайней мере, определять антигенную специфичность моноклональных антител, что отражено в нашей публикации в Journal of Immunological Methods. Мы надеемся, что созданные мутанты ВИЧ-1, изученные в различных тестах репликации, и лимфоидные клеточные линии с библиотекой GeCKO позволят на завершающем этапе нашего исследования провести эффективный скрининг библиотеки GeCKO и выявить возможно еще неизвестные факторы рестрикции ВИЧ-1.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В течение третьего года работы над проектом были получены лимфоидные клеточные линии CEM и Raji/CD4 c библиотекой нокаутов GeCKO. Проведен NGS-анализ полученных клеточных библиотек. Написаны скрипты для обработки и фильтрации данных FASTQ файлов. Для анализа данных GeCKO использованы последние опубликованные алгоритмы. В результате отобраны клеточные библиотеки с репрезентативностью выше 95%. Проанализированы гены, потерянные при переносе библиотеки в клеточные линии. Определено, что гены всех известных факторов рестрикции ВИЧ-1 (в виде гидовых РНК) представлены во всех полученных клетках с библиотекой нокаутов, т.е. последние пригодны для скрининга и поиска рестрикционных факторов. Поставлены скриниг-тесты для поиска рестрикционных факторов ВИЧ-1 в условиях межклеточной трансмиссии, т.е. при сокультивировании клеток-продуцентов CEM с библиотечными клетками Raji/CD4, и в условиях заражения свободным вирусом, выделенным от клеток Jurkat и добавленным к библиотечным клеткам Raji/CD4. В первом варианте, вследствие обнаруженного нами факта, что межклеточная трансмиссия нивелирует различия в инфекционной способности ВИЧ-1 дикого типа и мутантного по какому-либо акцессорному гену (Zotova et al., Virus Research 2018, under revision), мы получили 2-х кратные различия в чувствительности в ВИЧ-1 только между Vif(-) образцом и немутированным вирусом. Во втором случае, с инфекцией свободным вирусом, нам не хватило чувствительности, чтобы детектировать и сортировать инфицированные клетки по экспрессии флюоресцентных белков. Таким образом, мы проанализировали три образца Vif(-) методом NGS, нашли ряд генов-хитов (SMPD1, GGA2, PDCD5, SRSF10, GNAI3), которые, однако, не повторялись во всех трех образцах. Возможно необходимо будет проанализировать большее число генов-хитов с меньшими отличиями встречаемости по отношению к контролю и выявить те из них, которые повторятся в Vif(-) образцах. В связи с объективными сложностями скрининга библиотеки нокаутов для поиска факторов рестрикции, мы разработали противоположный скрининг-тест для поиска факторов репликации ВИЧ-1, а также вируса HTLV-1. В отличие от первых, эти скрининги основывались не на сортировке более чувствительных инфицированных клеток, детектируемых по экспрессии флюоресцентных белков-репортеров, а на выживаемости библиотечных клеток-мишеней, резистентных к заражению вирусом с множественным циклом репликации. В случае ВИЧ-1 мы использовали CXCR4-тропный изолят, а для заражения HTLV-1 сокультивирование с вирус-продуцирующими клетками MT2. Полученные после 1 и 2-х раундов инфекции клетки оказывались действительно резистентными, что измерялось по уровню продукции ВИЧ-1 p24 в супернатантах и инфекции HTLV-1 с вектором inLuc. NGS анализ резистентных клеток выявил ряд генов, важных для репликации данных вирусов. Проанализировав имеющуюся литературу по данному вопросу, наиболее интересными факторами репликации на наш взгляд оказались KPNA1 и CD82 для HTLV-1 и TGFBR1, SMU1, MAGEA3, NDUFA10, POLB и TNFRSF1A – для ВИЧ-1. С помощью метода double nicking мы получили нокаут по тетраспанину CD82 в клетках CEM и Raji/CD4 (Zotova et al., Viruses 2017), а нокаут по KPNA1 (импортину альфа5) получили с помощью разрабатываемого нами оригинального метода (заявка РНФ на 2018-2020 гг.). В перспективе мы получим нокауты по другим генам, обнаруженным в ходе скрининга библиотеки нокаутов, и выясним их роль в репликации ВИЧ-1 и HTLV-1.