Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В задачи первого года выполнения проекта входил детальный анализ литературных данных, планирование и проведение предварительных экспериментов по исследованию влияния на взаимодействие между различными формами клеточной гибели как способа борьбы с раком. С этой целью была проведена временная оценка активации каспазы-2 в процессе апоптоза, индуцируемого повреждениями ДНК. Получены данные об оптимальном временном интервале для изучения механизма активации каспазы-2, в частности сборки комплекса ее активации. С помощью гель-хроматографии была выделена высокомолекулярная фракция, которая содержит активную каспазу-2. Таким образом, нам удалось продемонстрировать, что каспаза-2 при инициации апоптоза образует высокомолекулярный комплекс, в котором вероятно и происходит ее активация. Нам удалось детектировать в имммунопреципитатах из высокомолекулярных фракций как прокаспазу-2, так и фрагменты ее расщепления. Анализ состава данного комплекса подвергается масс-спектрометрии. Исследована роль антиапоптотических белков Bcl-2, Bcl-XL, и Mcl-1 в аккумуляции клеток с морфологией, присущей митотической катастрофе (МК). Установлено, что уровень белков семейства Bcl-2 влияет на клеточную смерть, наступающую после МК, но не на вхождение клеток в МК. Полученные данные о взаимодействии между аутофагией и апоптозом позволили нам предположить, что подавление аутофагии может приводить к торможению пролиферации клеток немелкоклеточного рака и повышению их чувствительности к цисплатин-индуцированному каспазо-зависимому и -независимому апоптозу за счет стимуляции образования АФК. Данные по анализу экспрессии генов в клетках аденокарциномы легкого показал, что уровень экспрессии белка TSN в клетках аденокарциномы легкого, а также в опухолевых образцах значительно превышает экспрессию данного белка в нормальных фибробластах легкого и в образцах полученных из нормальных тканей этого органа. Детальный анализ данного феномена будет исследован в следующем году. За прошедший период нами опубликовано 3 научные статьи в международных журналах.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В задачи второго года входило продолжение анализа комплекса(ов) активации каспазы-2. Нами установлено, что ключевой компонент комплекса PIDDosome – адапторный белок RAIDD – не детектируется ни в одном из образцов после иммунопреципитации. Масс-спектрометрический анализ белков, участвующих в активации каспазы-2 в ответ на повреждения ДНК, также не выявил белков PIDD и RAIDD в исследуемых образцах, что свидетельствует об отсутствии этих белков в высокомолекулярном комплексе, содержащем каспазу-2. Следовательно, активация каспазы-2 в ответ на повреждения ДНК в данной модели происходила по PIDDosome-независимому пути. Показано, что уровень апоптоза в клетках с пониженной экспрессией белка RAIDD не отличался от контрольного. Более того, ингибирование синтеза RAIDD не приводило к появлению устойчивости клеток Caov-4 к повреждениям ДНК, что свидетельствует об отсутствии существенного вклада этого белка в механизм запуска апоптоза. Нами сделан вывод о том, что в клетках карциномы яичника в ответ на повреждения ДНК формируется новая, неописанная в литературе, альтернативная платформа, в составе которой активируется каспаза-2. Для выяснения роли аутокаталитического расщепления каспазы-2 при активации в составе инициаторного комплекса использованы конструкции содержащие полную молекулу каспазы-2 или каспазу-2 с мутированным аспарагином, а также FLAG на С-конце. Mутации каспазы-2, ингибирующие ее расщепление, не оказывают существенного влияния на сборку комплекса в составе которого происходила активация каспазы-2, и протеолитическую активность этого белка, что соответствует предложенной нами гипотезе активации инициаторных каспаз в макромолекулярных комплексах, которая предполагает, что димеризация и олигомеризация каспаз, но не их расщепление, являются ключевым событием, необходимым для их каталитической активации и запуска апоптоза, а активация каспазы-2 происходит в составе макромолекулярного комплекса без ее диссоциации. Результаты этих исследований суммированы в статьях в журналах Биоорганическая химия, ДАН и Cell. Mol. Life Sci. (Импакт фактор 5.8) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25323133). В результате изучения синергического эффекта ДНК-повреждающего препарата цисплатин и нехватки питательных веществ на программируемую гибель раковых клеток нами показано, что использование комбинации голодания с цисплатином приводит к появлению маркеров апоптоза на более ранних часах по сравнению с воздействием только цисплатином, что указывало на усиление клеточной гибели в условиях двойного стресса. Анализ уровня гибели продемонстрировал, что воздействие голодания и ДНК-повреждающего агента усиливало токсический эффект последнего, увеличивая долю апоптотической популяции на 48% в сравнении с клетками, обработанными только цисплатином – с 17,11% до 25,3% для клеток Caov-4 после 24 часов инкубации и с 26,5% до 36,9% для клеток HeLa. Важным аспектом исследования был анализ комплекса активации каспазы-2 в условиях депривации факторов роста с помощью метода гель-фильтрации. Были разработаны условия выделения данного комплекса с помощью гель-фильтрации и последующего осаждения с помощью ИП. Показано, что выделение комплекса в условиях депривации факторов роста и обработке цисплатином, не отличается от условий выделения его только при воздействии цисплатина. Согласно плана нами было проведено изучение локализации каспазы-2 в клетках Caov-4 в норме и после индукции апоптоза. Метод фракционирования позволил анализировать распределение белков между ядром и цитоплазмой на количественном уровне. Установлено, что каспаза-2 преимущественно локализуется в цитоплазме. C помощью флюоресцентной конфокальной микроскопии клеток Caov-4, трансфецированныx плазмидой, содержащей каспазу-2-GFP показано, что после обработки цисплатином происходит перераспределение флуоресцентной метки между цитоплазмой и ядром. Cделан вывод, что в клетках карциномы яичника линии Caov-4 происходит изменение локализации каспазы-2 в ответ на повреждение ДНК. Анализ возможной роли каспазы-2 как белка участвующего в переключении между апоптозом и некроптозом показал, что под действием цисплатина, часть популяции клеток CAOV-4 подвергается гибели по каспазо-независимому или некроптотическому пути. Не исключено, что происходящая транслокация каспазы-2 в ядро может быть связана с ее функцией в процессе некроптоза. Обсуждение данной проблемы суммировано в статье, опубликованной в журнале Cell. Mol. Life Sci. (Импакт фактор 5.8)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26346492) . Эксперименты по анализу роли АФК в развитии митотической катастрофы (МК) показали, что в ответ на действие кольцемида происходит аккумуляция АФК, а максимальная концентрация АФК коррелировала со временем начала развития МК. Так же было выявлено нарастание маркера повреждений ДНК, фосфорилированной формы гистона H2AX, после 24-48ч воздействия, а также нарастание фосфорилированной формы белка р53 в том же временном промежутке. Оценка потребления кислорода клетками выявила, что в то время как доксорубицин не оказывал существенного влияния на клеточное дыхание, кольцемид значительно его подавлял, особенно в нокаутных по 14-3-3 сигма белку клетках. Повышение уровня АФК и значительное подавление дыхания в ответ на действие кольцемида при индукции МК, указывают на вызванную дисфункцию митохондрий. Мы показали, что доксорубицин и кольцемид стимулируют переход белка Mcl-1 на внутреннюю мембрану митохондрий, что является одним из механизмов запуска митофагии и сенесенса. Анализ структуры митохондрий выявил значительные различия в клетках. Наибольшие изменения наблюдались в МК клетках. Таким образом, мы показали, что свойство МК предшествовать различным типам гибели не зависит от типа клеток, а митохондрии могут являться важными модуляторами в выборе конечного типа клеточной гибели. Обсуждение данной проблемы суммировано в статьях, опубликованных в журналах Drug Resist. Updates (Импакт фактор 9.12) (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1368764615000564), BBRC (Импакт фактор 2.3) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25998735), Молекулярная биология и Биохимия. Показано, что подавление экспрессии белка Dicer не только не повышало, но наоборот снижало апоптотический ответ клеток на цисплатину, что позволило сделать вывод, что участие TSN в регуляции устойчивости опухолевых клеток не связано с их функцией в составе RISC комплекса. Короткий лист отобранных белков-мишеней TSN указывалт на роль TSN в качестве медиатора химиорезистентности. Примечательно, что ни один из oписанных белков не был обнаружен ранее связанным с TSN-сигналлингом. Первым кандидатом был S100A11. Исследование экспрессии S100A11 после нокаута гена TSN установило его значительное подавление в пробах. Подавление TSN способствовало апоптозу клеток А549 после действия цисплатина. Kак и в случае подавления TSN, даун-регулирование S100A11 привело к потенциации апоптоза после обработки. Bысокий уровень белка S100A11 способствует устойчивости клеток аденокарциномы легких к цисплатине и этот эффект наблюдается в цепи реакций начинающихся TSN. Данные позволили предположить новую неописанную ранее роль S100A11 в регуляции устойчивости клеток аденокарциномы легких к химиотерапии. Нами выявлена цепь реакций с помощью которых S100A11 участвует в регуляции апоптоза и устойчивости к цитотоксическим воздействиям. Установлено, что S100A11 влияет на Аннексин А1-опосредованное ингибирование цитозольной фосфолипазы А2 (cPLA2) участвующей в каскаде арахидоновой кислоты (AK). Увеличение выхода АК и образование их метаболитов важно для повышения чувствительности опухолей к терапии. Подавление S100A11 снижает уровень комплекса S100A11-Annexin и приводит к уменьшению ингибирования PLA2. Подавление S100A11 выражалось в двухкратном увеличении продукции супероксида после обработки цисплатиной. Так, в клетках рака легких обработанных платина-содержащими соединениями подавление S100A11 приводит к повышению активности PLA2, усиливает продукцию митохондриального супероксида и повреждению ДНК, способствуя развитию апоптоза. Важно, что клинические образцы больных аденокарциномой легких показали повышенный уровень S100A11 (от 1.3 до 8 раз) по сравнению с нормальными тканями (в 14 из 17 пар (82%)). Повышенная экспрессия cPLA2 была выявлена в 64% опухолевых проб, в которых также экспрессировался S100A11. Bо всех пробах уровень экспрессии TSN был повышен. Эти данные указывают на физиологическое значение TSN-зависимой регуляции S100A11, которая влияет на активность PLA2 в аденокарциноме легких. Таким образом мы обнаружили новую цепь событий (TSN-S100A11-PLA2), регулирующую супероксид-зависимый апоптоз, запускаемый платина-содержащими препаратами в клетках аденокарциномы легких, который может быть таргетирован в новой противоопухолевой терапии. Анализ сочетанного действия сердечных гликозидов (СГ) уабаина, дигоксина и дигитоксина с цисплатином и этопозидом показал, что СГ по отдельности не оказывают токсического действия на опухолевые клетки a их комбинация c этопозидом вызывала более высокую гибель клеток по сравнению с действием только этопозида. Совокупность данных позволила заключить, что уабаин и дигоксин вызывают резистентность к действию цисплатина в клетках колоректального рака, а в сочетании с этопозидом, наоборот, сенсибилизируют клетки к действию препарата и вызывают более заметную гибель клеток, чем эффект от одного этопозида. Проверка трех гипотез показала роль [Ca2+] и ингибирования фермента топо II в нарушении ДНК и гибели клеток. Так, показана возможность применения СГ в противоопухолевой терапии, однако их использование с препаратами может вызывать как усиление гибели опухолевых клеток, так и эффект резистентности. Нам удалось раскрыть механизмы этих эффектов. Результаты данных исследований суммированы в статьях: Oncotarget (Импакт фактор 6.4) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25940438), Int. J. Dev. Biol. (Импакт фактор 2.1)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26374533) , и Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
С помощью разработанных методов и подходов был продолжен анализ комплекса(ов) активации каспазы-2. Нами были созданы генетические конструкции, содержащие ген каспазы-2 и дополнительную аминокислотную последовательность для аффинной хроматографии. Также с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 была создана стабильная линия раковых клеток Caov-4, которая отличается практически полным отсутствием эндогенной каспазы-2. Для получения образцов, содержащих каспазу-2 и ее партнеров, клетки линий Caov-4 и Caov-4-каспаза-2 были трансфицированы полученными конструктами, далее клетки обрабатывали химиотерапевтическим агентом цисплатином. Масс-спектрометрический анализ полученных образцов выявил три группы потенциальных партнеров каспазы-2: 1) белки, участвующие в убиквитинилировании и деградации; 2) киназы, фосфатазы и белки, регулирующие клеточный цикл; 3) субстраты каспазы-2. Также было продолжено исследование феномена увеличения чувствительности раковых клеток к химиотерапевтическому ДНК-повреждающему агенту цисплатину в условиях отсутствия сыворотки, как модели недостатка питательных веществ in vitro. С помощью метода siRNA, а также при использовании клеток Caov-4 дефицитных по каспазе-2 было показано, что каспаза-2 играет важную роль в запуске апоптоза в ответ на повреждения ДНК, и ее недостаток в клетке приводит к существенному замедлению процессов программируемой гибели в равной степени в полной и бессывороточной среде. Также с помощью гель-фильтрации и Вестерн-блота были проанализированы кинетические параметры формирования высокомолекулярных комплексов, активирующих инициаторные каспазы-2, -8, -9 в ответ на обработку цисплатином или комбинаторное воздействие цисплатина и условий SD. Полученные данные подтвердили, что комбинация цисплатина и условий SD приводила к ускорению сборки высокомолекулярного комплекса активации каспазы-9. Таким образом, вероятно, пермеабилизация внешней мембраны митохондрий, выход цитохрома с и, соответственно, формирования апоптосомы играют ключевую роль в усилении клеточной гибели в условиях депривации сыворотки. Разработка протокола быстрого и эффективного выделения ядерной фракции позволила проанализировать распределение инициаторных каспаз-2, -8, -9 и эффекторной каспазы-3 в раковых клетках до и после обработки цисплатином. Полученные данные свидетельствовали о транслокации как проформ, так и активных форм каспаз ядро в ответ на повреждения ДНК. Анализ с помощью конфокальной микроскопии позволил подтвердить полученные результаты. Изучена роль белка Parkin в развитии митофагии, сенессенса и митотической катастрофы (МК), а также возможность влияния активации/ингибирования митофагии на чувствительность опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. Установлено, что уровень этих белков различен и зависит от уровня МК в клетках. Создана модель Parkin-опосредованной элиминации митохондрий и показано, что в условиях дефицита митохондрий клетки более подвержены МК. Исследование взаимосвязи между апоптозом и MC и каким образом митохондриально-полученные АФК могут модулировать оба процесса показало повышенную стимуляцию потребления кислорода при обработке доксорубицином, в HCT116 клетках, лишенных 14-3-3 сигма белка. Это объясняется усилением потребления кислорода и связанных с ними утечки электронов с образованием супероксидных радикалов. Было установлено зависящее от времени накопление гамма-H2AX в HCT116 клетках, лишенных 14-3-3 сигма белка. Эти клетки были более чувствительны к индукции MC и NAC не защищал их от MC. Обнаружено, что ни повреждения ДНК, ни MC не зависят от АФК. В противоположность этому, индукция апоптоза стимулировалась АФК и подавляется антиоксидантами, вызывая накопление клеток на стадии MC. По-видимому, митохондрии не участвуют в регуляции MC напрямую, а через стимуляцию апоптоза. Индукция апоптоза ослабляет уровень МС, в то время как подавление апоптоза увеличивало число клеток с полиплоидными ядрами. В случае подавления апоптоза, накопление клеток с MC приводит либо к некрозу, либо к старению. Наши данные показывают, что даже при нарушениях апоптоза уровень МС может быть повышен, что приведет к улучшению противоопухолевой терапии. По результатам оценки различных параметров митохондрий (АФК, потенциал, структура), а также анализу фосфорилированной формы гистона H2A.X при индукции МК, была выявлена дисфункция митохондрий. Показано, что малые дозы выхода цитохрома с увеличивают нестабильность клеточного генома. Была выдвинута гипотеза, что в условиях развивающегося клеточного стресса после индукции МК, дальнейшая нестабильность генома служит «петлей амплификации» для развития МК и провоцирует инициацию либо аутофагии, либо митофагии. Детальный анализ структуры митохондрий выявил изменение митохондриальной сети в отдельные пикнотические сфероиды при индукции МК. Полученные данные, а также данные по транслокации белка Mcl-1 на внутреннюю мембрану митохондрий, позволили предположить, что индукция МК может приводить как к митофагии, так и аутофагии. Анализ белков-маркеров митофагии (Parkin, PINK1), а также аутофагии (р62, LC3) выявил, что индукция МК в клетках рака прямой кишки HCT116 дикого типа (wt) и нокаутного по 14-3-3 сигма белку индуцирует развитие аутофагии. Для детального подтверждения взаимосвязи МК и аутофагии нами начато получение при помощи технологии CRISPR-Cas линия другой этиологии, нокаутные по Atg13 клетки аденокарциномы легкого (U1810 KO). Работа с данными клетками будет продолжена в следующем году. С помощью молекулярно-биологических, биохимических и морфологических методов изучена роль взаимодействия между белками TSN, BNIP3 и IGFBP2 в регуляции чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. Установлено, что в результате нокаута TSN уровень мРНК белка S100A11 сильно подавлен, а уровень белков BNIP и IGFBP2 увеличился по сравнению с контролем. C помощью технологии CRISPR/Cas9 мы получили и детально охарактеризовали клеточные линии аденокарциномы легкого нокаутные по белкам TSN (A549 TSNKo), IGFBP2 (A549 IGFBP2Ko) и BNIP3 (A549 BNIP3Ko). Анализ гибели клеток показал усиление чувствительности к цисплатине в линиях клеток немелкоклеточного рака легких нокаутных по белкам TSN и BNIP3. Этот эффект был нивелирован при действии комбинации игибиторов аутофагии с цисплатином по сравнению с действием только цисплатина. Анализ белка-маркера аутофагии LC3 выявил, что клетки А549 имеют низкий базальный уровень экспрессии данного белка, который не меняется после индукции клеток цисплатином. А549 нокаутные по TSN также имеют низкий базальный уровень экспрессии LC3. Выключение BNIP3 в клетках А549 привело к увеличению базального уровня и накоплению второй формы LC3. Анализ функциональных классов белков, связанных с BNIP с помощью программы Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, CA, USA; http://www.ingenuity.com) дал возможность отобрать сети взаимодействия белков, регулируемых BNIP и участвующих в регуляции аутофагии и апоптоза, выживаемости и ответа на повреждения ДНК. Наиболее интересные с точки зрения возможного участия в регуляции чувствительности к химиотерапии белки отобраны и начата проверка механизма их регуляции. Впервые суммированы имеющиеся в литературе данные о биохимии и функциях белка TSN, которые опубликованы в виде статьи в международном журнале. Изучение воздействия сердечных гликозидов (СГ) на опухолевые клетки и их возможное использование в комбинации со стандартными химиотерапевтическими препаратами показало, что три СГ, уабаин, дигоксин и дигитоксин, обладают некоторой цитотоксичностью. Изучение совместного действия СГ и химиопрепаратов цисплатина и этопозида показало, что комбинация СГ с этопозидом приводила к заметному и достоверному увеличению гибели опухолевых клеток. Важно отметить, что нами подтверждены противоположные эффекты СГ в комбинации с препаратами, которые имеют широкое использование в клинической практике и потенциально могут быть назначены совместно с СГ если у пациента наблюдаются также проблемы с сердечной деятельностью. Одним из наиболее распространенных механизмов устойчивости опухоли к терапии является экспрессия на поверхности клетки энергозависимого насоса, “выкачивающего” противоопухолевые препараты. Ранее нами было показано, что в условиях гипоксии значительно снижается чувствительность клеток рака прямой кишки НСТ116 к цисплатине и доксорубицину. Мы исследовали механизмы вовлечения P-gp в устойчивость клеток к действию доксорубицина в гипоксических условиях. Состояние гипоксии модулировали добавкой в суспензию клеток дефероксамина (ДФО). Инкубация клеток рака толстого кишечника НСТ116 с ДФО стимулировала стабилизацию субъединицы HIF1α. ДФО вызывал появление небольшого количества апоптотических клеток, однако он ингибировал апоптоз, индуцированный доксорубицином. Накопление клетками доксорубицина зависело от концентрации препарата и от времени его инкубации. Инкубация с ДФО снижала содержание доксорубицина в клетке. Ингибирование P-gp верапамилом отменяло снижение содержания доксорубицина и значительно повышало его внутриклеточный уровень. Таким образом, полученные в работе результаты показывают, что активация HIF1α сопровождается снижением накопления доксорубицина в клетке. Этот процесс блокируется верапамилом, что указывает на участие в этом процессе АВС-транспортера P-gp. Полученные в нашей работе данные позволяют рассматривать гликопротеин P-gp в качестве мишени для стимуляции терапевтической активности препаратов, что, несомненно, будет способствовать эффективной элиминации опухолевых клеток при использовании терапевтических концентраций противоопухолевых средств. За отчетный период нами опубликовано 6 статей в международных и 2 – в российских журналах. Была зарегистрирована заявка на патент, было сделано 11 докладов на международных конференциях (из них 8 приглашенных), получены 2 Первых премии, защищены 2 курсовые работы, организованы и проведены 2 курса для студентов МГУ.