Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Проект посвящен разработке нового метода доставки кардиопротективных агентов в зону ишемии миокарда с помощью органических наноразмерных носителей. На первом году проекта достигнуты следующие результаты. Проведен патентный поиск, выявивший 3 патента. Патенты относятся к методам синтеза субстанций, подобных исследуемым в рамках гранта. Также замечено, что большинство заявок, относящихся к наноразмерным носителям на основе таких материалов были отозваны. Синтезированы наночастицы представляющие собой трехмерносшитый полимер полиорганосилоксана. Методом поликонденсации синтезированы наночастицы полиорганосилоксана различных размеров. Получены наночастицы полиорганосилоксана с ядром из кремнезема (НЧК-ПОС), путем привития спейсера на аминированный кремнезем. Определены размер и дзета-потенциал наночастиц приготовленных суспензий наночастиц на приборе Zetasizer Nano. Исследование полученных наночастиц при помощи электронного и интерференционного микроскопов показало не применимость данного метода ввиду относительно большой прозрачности исследуемого материала. Химический состав полученных наночастиц подтвержден при помощи ИК-спектров на приборе Shimadzu FTIR-8400S. Адсорбционная иммобилизация действующих веществ на поверхности полученных наночастиц показала свою неэффективность. Применение этой методики будет рассмотрено дополнительно после проведения экспериментов по снятию изотерм адсорбции действующих веществ. Иммобилизация действующих веществ на поверхности наночастиц осуществлялась в две стадии. 1. Аминирование поверхности наночастиц. 2. Иммобилизация действующего вещества. Для примера в качестве модельных действующих веществ для отработки методики выбраны флуоресцеин, аденозин и брадикинин. Флуоресцеин применяется в качестве флуоресцентной метки и является средством диагностики. Остальные три вещества являются лекарственными средствами. Иммобилизацию флуоресцеина проводили координационно-ионным методом. Иммобилизацию аденозина и брадикинина проводили ковалентным методом. В работе проводили синтез предшественников наночастиц хитозана – N-сукцинил-хитозана и N-глутарил-хитозана. В работе исследовали N-сукцинил-хитозан и N-глутарил-хитозан. Состав полученных соединений подтвержден по данным 1HЯМР спектроскопии и элементного анализа. Доказано что наночастицы НЧК-ПОС не вызывают изменений показателей системной гемодинамики, что говорит об отсутствии их острой токсичности. Для дальнейшей оценки применимости НЧК-ПОС в качестве наноразмерных носителей для доставки лекарственных препаратов требуется исследование хронической токсичности. Исследованные предшественники хитозановых наночастиц не вызывают изменений показателей системной гемодинамики, что говорит об отсутствии их острой токсичности.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Установлено, что N-карбоксиацильные производные хитозана N-сукцинил-хитозан и N-глутарил-хитозан гемосовместимы, так как проявляют антиагрегантные и антикоагулянтные свойства при контакте с кровью человека и не вызывают гемолиза эритроцитов крысы in vivo и in vitro. Также установлено, что наночастицы хитозана, синтезированные из N-карбоксиацильных производных хитозана, проявляют антикоагулянтные и выраженные антиагрегантные свойства. Полученные данные по гемосовместимости производных хитозана и наночастиц хитозана, синтезированных на основе N-карбоксиацильных производных хитозана, дают основания для дальнейшего изучения и использования их в качестве наноносителей с целью направленной доставки лекарственных средств. Наночастицы немодифицированного хитозана (НЧХ), представляющие интерес в связи со сравнительно более простой технологией синтеза, также были исследованы в отношении гемосовместимости. НЧХ, введённые внутривенно в дозе 0,8мг/кг, не вызывают внутрисосудистого гемолиза эритроцитов, а также не влияют на системную гемодинамику и дыхательную деятельность у наркотизированной крысы в остром эксперименте. При анализе 3D изображений эритроцитов крысы, инкубированных с НЧХ, не было выявлено каких-либо изменений в их морфологии. 3D изображения эритроцитов были получены с использованием лазерного сканирующего микроскопа МИМ-340. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии спонтанного гемолиза эритроцитов крысы и внутрисосудистого гемолиза in vivo и при данной концентрации НЧХ, что даёт основание для дальнейшего изучения НЧХ в качестве возможного наноносителя лекарственных средств. Получены результаты изучения динамики биораспределения наночастиц полиорганосилоксана с кремнезёмным ядром (НЧК-ПОС), которые свидетельствуют о преимущественной аккумуляции наночастиц в печени через час от момента внутривенного введения наночастиц в дозе 64 мг/кг. Максимум накопления НЧК-ПОС в печени наблюдался через 72 часа, что косвенно свидетельствует о длительной циркуляции наночастиц. В остальных органах регистрируется в 2-3 раза меньший уровень содержания кремния, чем в печени. К 10-му дню наблюдения уровень кремния возвращается к фоновым значениям, за исключением лёгких и мозга, в которых уровень содержания кремния сохранялся почти в два раза выше фонового уровня. На 4-ой неделе уровень содержания кремния во всех органах снижался до фонового. Полученные данные свидетельствуют о полной элиминации НЧК-ПОС из организма за 4 недели. С использованием флуоресцентной метки получены данные по биораспределению наночастиц немодифицированного хитозана через 2 часа от момента введения в дозе 0,8 мг/кг. Результаты измерения интенсивности флуоресцентного излучения свидетельствуют о том, что печень равно как и другие органы ретикулоэндотелиальной системы (селезёнка, лёгкие, почки) является основным органом биораспределения НЧХ. При помощи флуоресцентной метки установлено, что наночастицы немодифицированного хитозана накапливаются в зоне ишемически-реперфузионного повреждения. Меченный хитозан, введённый внутривенно в дозе 0,8 мг/мл в момент восстановления коронарного кровотока по инфаркт-зависимой коронарной артерии, накапливался в зоне ишемически-реперфузионного повреждения. Это является доказательством возможности использования НЧХ для доставки лекарственных средств в повреждённый миокард. Для оценки эффективности кардиопротекции путём направленной доставки аденозина, иммобилизованного на НЧК-ПОС и НЧХ были выполнены эксперименты с моделированием ишемически-реперфузионного повреждения миокарда крысы. НЧХ вводились внутривенно в виде коньюгатов НЧК-ПОС-аденозин или НЧХ-аденозин в объёме 1 мл в течение 10 минут, начиная с 25-ой минуты ишемии. Аденозин в использованной дозе 300 мкг/кг в мин., свободный или связанный в этой дозе с НЧК-ПОС и НЧХ, введённый в указанном режиме за 5 минут до начала реперфузии, не обладал значимым инфаркт-лимитирующим действием, что требует дальнейшего поиска оптимальной дозировки и времени введения.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1.Оценка возможности избирательного накопления наночастиц кремнезема в зоне ишемии-реперфузии миокарда. В экспериментах с внутривенной инфузией наночастиц кремнезема отмечалось резкое увеличение содержания кремния в печени, по уровню значительно превосходящее его содержание в сердце, что свидетельствует об активном захвате наночастиц элементами ретикуло-эндотелиальной системы печени. Полученные предварительные данные говорят о том, что внутривенное введение наночастиц кремнезема диаметром 10 нм животным с ишемией-реперфузией миокарда сопровождалось избирательным накоплением наночастиц в зоне повреждения. Этот факт позволяет сделать предположение о том, что присоединение к поверхности наночастицы лекарственных препаратов из группы кардиопротекторов (например, брадикинина, эритропоэтина, открывателей АТФ-чувствительных калиевых каналов, сосудистого эндотелиального фактора роста и др.) будет приводить к избирательному повышению концентрации препаратов в поврежденном миокарде. 2.Возможность использования органических наноматериалов для доставки кардиопротекторов в зону ишемии-реперфузии миокарда с целью повышения эффективности кардиопротекции остается малоизученной. В качестве нанопереносчиков нами предложены наночастицы немодифицированного хитозана, его карбоксиацильные производные – сукцинил-хитозан (СХ) и глутарил-хитозан (ГХ), а также наночастицы полиограносилоксана с кремниевым ядром (НЧК-ПОС). Гипотеза основывается на том, что введённые внутривенно наночастицы хитозана с лекарственным препаратом будут пассивно накапливаться в зоне ишемически-реперфузионного повреждения, где имеется повышенная проницаемость микрососудов. Целью данной работы явилось изучение цитотоксичности наночастиц немодифицированного хитозана (НЧНМХ), наночастиц СХ и ГХ, а также НЧК-ПОС по их влиянию на жизнеспособность клеток в МТТ-тесте. При изучении цитотоксичности исследуемых наноматериалов установлены дозы и время экспозиции наночастиц, при которых возникает цитотоксический эффект. При добавлении любой концентрации полимера СХ (0,001%, 0,01% и 0,1%) к культуре клеток их жизнеспособность не уменьшалась через 24, 48 и 72 часа от начала экспозиции в МТТ-тесте. Полимер ГХ в тех же дозах достоверно снижал жизнеспособность клеток через 48 и 72 часа. В отличие от полимера N-сукцинил-хитозана, добавление наночастиц сукцинил-хитозана (НЧСХ) в концентрациях 0,0005%, 0,005% и 0,05% снижало жизнеспособность клеток через 48 и 72 часа. При добавлении любой концентрации НЧГХ, жизнеспособность клеток уменьшалась на 24, 48 и 72 часа. Добавление НЧХ в концентрации 0,002 мг/мл, 0,02 мг/мл и 0,2 мг/мл уменьшало жизнеспособность клеток через 72 часа. Добавление НЧК-ПОС в концентрациях 1,3 мг/мл уменьшало жизнеспособность клеток через 24 часа и в концентрациях 0,013 мг/мл и 0,13 мг/мл – через 72 часа Таким образом, полимеры СХ и ГХ имеют разную цитотоксичность и по-разному влияют на клеточную культуру HL-1. Вероятно, ГХ в большей степени, чем СХ, взаимодействует с мембранами клеток и вызывает снижение жизнеспособности клеток в культуре на вторые сутки после добавления к культуральной среде в МТТ тесте. Все тестируемые наночастицы имели цитотоксический дозо-зависимый эффект. Цитотоксичность НЧ немодифицируемого хитозана значимо проявляется только через 72 часа. Учитывая это, а также результаты МТТ-теста, целесообразно дальнейшее использование всех исследуемых наночастиц и полимеров в разработке наноразмерных носителей для направленной доставки лекарственных средств за исключением ГХ и НЧГХ, которые требуют дальнейшей модификации с последующим биологическим тестированием для поиска меньшей цитотоксичности. 3.Изучение субхронической токсичности наночастиц полиорганосилоксана с кремнезёмным ядром, наночастиц немодифицированного хитозана и наночастиц сукцинил-хитозана на крысах с SPF статусом в 14-дневном эксперименте. В данном исследовании изучалась субхроническая токсичность исследуемых наночастиц на крысах после их однократного внутривенного введения: НЧК-ПОС в дозах 8 мг/кг, 40 мг/кг и 136 мг/кг, НЧНМХ в дозах 2 мг/кг, 4 мг/кг и 5,12 мг/кг, НЧСХ в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг и 4 мг/кг. Все животные, получившие максимально возможные концентрации суспензий исследуемых наночастиц, выжили и их состояние здоровья не требовало выведения из эксперимента. Общее состояние животных в опытных группах и их неврологический статус были сравнимы с контрольной группой. Для всех исследуемых наночастиц наблюдался характерный дозо-зависимый токсический эффект на динамику массы тела, который выражался в достоверном снижении веса тела на следующий день после введения и в достоверном снижении прибавки веса по сравнению с контролем в течение одной недели с последующим частичным восстановлением ко второй недели наблюдения. Наряду со снижением массы тела, для всех исследуемых наночастиц наблюдался характерный дозо-зависимый токсический эффект и на динамику потребления корма, который выражался в уменьшении потребления корма на следующий день после введения и в течение одной недели с последующим восстановлением ко второй недели наблюдения. В клиническом анализе крови всех групп, выполненном на гематологическом анализаторе ABACUS JUNIOR VET, наблюдался умеренный лейкоцитоз (повышение в среднем на 50%) на следующий день после введения тестируемых наноматериалов и в контрольной группе. Только в группе НЧК-ПОС с максимальной концентрацией наночастиц 136 мг/кг выраженность лейкоцитоза достигала значимого уровня (повышение в среднем на 250%). При этом, не было признаков анемии или тромбоцитопении. Таким образом, по предварительным данным исследования острой токсичности максимально возможных доз наночастиц хитозана (4 мг/кг) и наночастиц сукцинил-хитозана (4 мг/кг) и не максимальной дозы НЧК-ПОС в (40 мг/кг) имеют равную токсичность, которая проявляется в небольшой потере массы тела через сутки от момента введения и замедлении в прибавке веса в течение двух недель – всего периода наблюдения. Летальных исходов не было ни в одной группе. При этом НЧК-ПОС имеют достоверно меньшую токсичность (по показателю прибавки веса), чем наночастицы хитозана и производных хитозана, что возможно связано с их отрицательным зарядом. В отличие от НЧК-ПОС, наночастицы немодифицированного хитозана и сукцинил-хитозана имеют положительный заряд. 3.1 Изучение биораспределения хитозана с использованием окраски гистологических срезов по Грокотт. Применение этого метода окраски по Грокотт позволило диагностировать микозы и изучить особенности их патоморфогенеза. При проведении поиска на возможность окраски хитозана средствами диагностики микозов установлено, что хитозан не окрашивается Шик-реакцией, а окрашивается окраской по Грокотт. Это новый подход, который не описан ранее в литературе. 4.Оценка кардиопротективного эффекта брадикинина в остром эксперименте. В работе проводилась оценка инфаркт-лимитирующего эффекта брадикинина с использованием модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда у крыс. При выявлении кардиопротективного эффекта, брадикинин будет использован для создания комплексов препарат-носитель для экспериментов по направленной доставке кардиопротектора в инфаркт миокарда. Брадикинин не проявил инфаркт-лимитирующего эффекта в дозе 0,1 мг/кг и размер инфаркта в этой группе составил 62,5±12,5, что достоверно не отличается от размера инфаркта в контрольной группе 57,53±5,32. По-видимому, доза брадикинина оказалась недостаточной, чтобы существенно повысить толерантность сердца к ишемии-реперфузии. Нами была использована субгипотензивная доза брадикинина. В литературе есть указания на эффективность дозы брадикинина, вызывающей снижение АД на 30% от исходного уровня. В дальнейших экспериментах нами планируется использовать более высокие дозы брадикинина, вызывающие снижение уровня АД до указанного уровня. 5.Оценка кардиопротективной эффективности брадикинина на модели инфаркта миокарда в хроническом эксперименте. Моделирование локального ишемически-реперфузионного повреждения миокарда проводилось аналогично способу, описанному в остром эксперименте, но в отличии от острого эксперимента, грудная клетка ушивалась и животное восстанавливалось после операции. Период постинфарктного наблюдения составил 28 дней. На момент написания отчёта физиологическая часть исследования закончена. Получены данные физиологических исследований ( ЭХОКГ) на модели инфаркта миокарда в хроническом эксперименте.Исходно и через 28 дней после операции как в группе Контроль, так и в группе Брадикинин показатели ЭХОЭКГ достоверно не различались. 6. Разработан новый способ интраоперационной визуализации ишемически-реперфузионного повреждения миокарда. При отработке методики биораспределения наночастиц хитозана с помощью индоцианиновой метки (индоцианин зелёный), было установлено, что введённый внутривенно свободный (не связанный с наночастицами) индоцианин накапливается в зоне ишемически-реперфузионного повреждения миокарда. Данное наблюдение имеет большое практическое значение в интраоперационной диагностике повреждения сердечной мышцы. Этот феномен позволяет визуализировать зону инфаркта на поверхности сердца при операции на открытом сердце в инфракрасном свете. Указанный технический результат достигается путём освещения поверхности сердца возбуждающим излучением, регистрацию изображения в свете флуоресценции и анализ изображения, перед котором пациенту заранее внутривенно вводят индоцианин зеленый (ИЦЗ) и через 10-30 минут после введения регистрируют флуоресцентное изображение при излучении возбуждения 780-810 нм и излучении регистрации 820-900 нм. В литературе нет описания такого способа визуализации ишемчески-реперфузионного повреждения (ИРП). Механизм визуализации ИРП с помощью ИЦЗ изучен нами экспериментально на крысах и заключался в возникновении контраста свечения ИЦЗ между зоной ИРП и окружающей непоражённой зоны, который возникает следующим образом. После внутривенного введения ИЦЗ сразу начинает связыватся с плазматическими белками, включая альбумин, и в связанном виде захватывается печенью. Через час ИЦЗ полностью выводился печенью и почками из кровотока в две фазы. В первую, быструю фазу (20 минут), органы выведения способны быстро, за 5-10 минут понизить концентрацию ИЦЗ в крови, а через 20 минут в плазме остаётся до 4% от исходной концентрации. Визуализация зон ИРП миокарда связана, по-видимому, с нарушением проницаемости сосудов в патологической зоне, где он надолго задерживается из-за малой скорости вывода из организма интерстициальной (межклеточной) жидкости.Данный способ заявлен как изобретение, получен приоритет.