Биологические препараты для защиты растений от насекомых-вредителей (биоинсектициды) на основе энтомопатогенных микроорганизмов (паразитические грибы, поражающие насекомых) являются перспективной альтернативой химическим препаратам. Они используются повсеместно, но особо популярны на территориях, где запрещено или нежелательно использовать «химию» (тепличные хозяйства, лесопарковые зоны), а также при производстве продукции органической и для питания детей. Однако грибные препараты отличаются высокой зависимостью от погодных условий и, соответственно, нестабильным действием на вредителей, а также порой низкой эффективностью. Поскольку взаимоотношения насекомых и грибов сложились очень давно, они насчитывают миллионы лет, устойчивая система паразит — хозяин вполне нормально существует в естественных условиях. Поэтому грибам невыгодно полностью уничтожать популяцию своего носителя — это может также привести к снижению численности гриба. С другой стороны, насекомые в результате коэволюции выработали целый комплекс систем и реакций для защиты от этих микроорганизмов.
«Наше исследование было направлено на поиск защитных механизмов насекомых-вредителей и факторов вирулентности (ядовитости для насекомых)у грибов, чтобы узнать, как увеличить эффективность препаратов на их основе. Известно, что для этого можно использовать как классические подходы (синергические добавки, селекцию штаммов и прочее), так и современные молекулярно-генетические технологии (генетическую инженерию, РНК-интерференцию и так далее). Используя эти подходы для совершенствования биологических препаратов, крайне важно знать, какие факторы вирулентности гриба играют существенное значение в инфекционном процессе (для их усиления) и как насекомые от них защищаются (для блокирования этих систем)», — рассказал заведующий лабораторией биологической защиты растений и биотехнологий Новосибирского государственного аграрного университета, заведующий лабораторией регуляции микробиоценозов сельскохозяйственных животных и растений Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий РАН доктор биологических наук Иван Михайлович Дубовский.
В своей работе ученые использовали известный модельный вид насекомых — вощинную огневку (Galleria Mellonella), которая является вредителем в пчеловодстве, а также широко используется как объект для лабораторных исследований по всему миру. Для заражения специалисты взяли один из самых популярных грибов, применяемых при создании биологических препаратов, — Metarhizium, который может инфицировать насекомых из разных отрядов. В естественных условиях он, попадая на поверхность (кутикулу) этих беспозвоночных животных, прорастает через их покровы, размножается внутри и убивает хозяина, после чего образует конидии, которые могут заражать других насекомых. Гриб опасен для таких известных вредителей сельского хозяйства, как колорадский жук, саранча, капустная моль и хлопковая совка. Кроме того, он способен убивать и кровососущих комаров, если попадет на их тело или в кишечник личинки. В эксперименте исследователи моделировали классический способ заражения насекомых, то есть проникновение гриба через покровы личинок.
Среди основных факторов вирулентности, атакующих насекомых и обеспечивающих успешное развитие на хозяине, особое значение имеет группа протеолитических ферментов (протеаз), которые отвечают за начальный этап инфекционного процесса в тот момент, когда гриб проникает через покровы животного. Эти ферменты буквально растворяют кутикулу насекомого. Гриб может синтезировать множество различных протеаз, поэтому перед учеными стоит задача определить, какие из них отвечают за успешное преодоление защитных систем вредителей.
РНК-интерференция — это процесс избирательного подавления экспрессии генов. Это интересный биотехнологический прием, широко используемый в биологии и медицине. В частности, RNAi используют и в защите растений для уничтожения различных вредителей, а также на их основе создают препараты, трансгенные растения и микроорганизмы с инсектицидной активностью (способные бороться с насекомыми).«Для нашего исследования мы использовали металлопротеазы, значение которых в инфекционном процессе остается малоизученным. Однако известно, что именно к этой группе ферментов насекомые в ходе эволюции сформировали специфический ингибитор (IMPI), связывающийся с металлопротеазами гриба и защищающий организм от их протеолитической активности. При помощи РНК-интерференции (RNAi) мы заблокировали IMPI, что позволило нам изучить значение данного гена в защитных реакциях, а также роль данных протеаз как фактора вирулентности», — прокомментировал Иван Дубовский.
«RNAi действует за счет разрушения матричной РНК целевого гена с помощью специально сконструированной конструкции двухцепочечных РНК. В нашем исследовании установлено, что дцРНК, сконструированная для блокировки ингибитора протеаз гриба, оказывала влияние на ряд других генов, связанных с иммунной системой насекомых. Причем уровень воздействия отличался в зависимости от ткани животного. Мы отметили значительное увеличение экспрессии генов иммунной системы в ответ на RNAi в покровах и жировом теле насекомых. Возможно, такой ответ иммунитета связан со стремлением насекомых компенсировать подавление ингибитора протеаз РНК-интерференцией. Это очень интересное открытие, так как дает новые возможности в изучении процесса РНК-интерференции у насекомых, ведь к RNAi у вредителей тоже, вероятно, может выработаться устойчивость. Кроме того, в результате работы мы пришли к выводу, что блокирование IMPI повышает смертность насекомых от грибов на 20 %, что создает предпосылки к дальнейшему изучению и использованию металлопротеаз гриба и их оппонента у насекомых — ингибиторов IMPI», — добавил Иван Дубовский.
Кроме того, уникальность исследования ученых в том, что они впервые проанализировали вклад металлопротеаз гриба в инфекционный процесс с помощью RNAi и определили важность этих ферментов для грибного патогенеза, а также выяснили, что их уровень необходимо учитывать для подбора штаммов продуцентов биоинсектицидов. «На примере вощинной огневки мы установили, как начать процесс РНК-интерференции у насекомых. Следующий этап — это поиск экономически и экологически оправданных способов запуска RNAi у других беспозвоночных членистоногих животных, имеющих важное хозяйственное значение. В частности, мы планируем использовать РНК-интерференцию для борьбы с колорадским жуком, чему посвящен один из наших проектов РНФ. В обозримой перспективе мы хотим предложить высокотехнологичный и экологически безопасный способ контроля численности данного вредителя. Один из применяемых нами подходов — запуск RNAi с использованием различных микроорганизмов. Если этот способ будет успешен, мы расширим список видов вредителей, которых можно уничтожать с помощью РНК-интерференции», — отметил ученый.
