Новости

14 октября, 2021 11:08

Комару помогают пережить засуху трегалоза и ионы кальция

Источник: PCR News
Личинки африканских комаров Polypedilum vanderplanki обладают уникальной засухоустойчивостью. Ученые из Японии и России создали инструмент для редактирования генома клеток комара в культуре и с его помощью исследовали сигнальные пути, которые позволяют насекомому переживать практически полное обезвоживание. С помощью этого инструмента можно будет модифицировать клетки комара для экспрессии ценных белковых продуктов.
Комар Polypedilum vanderplanki, самец и самка. Источник: Richard Cornette et al. / Systematic Entomology, 2017

Японские и российские ученые обнаружили новые механизмы устойчивости к высыханию у Polypedilum vanderplanki — комаров-звонцов, обитающих в Нигерии, Уганде и других странах Африки. Этот вид знаменит тем, что его личинки способны к ангидробиозу — длительному существованию в состоянии почти полного обезвоживания. Во время засухи тело личинки теряет более 97% влаги, однако насекомое не погибает и после увлажнения быстро возвращается к жизни. При дегидратации в телах личинок из гликогена жирового тела синтезируется дисахарид глюкозы трегалоза, который замещает воду и сохраняет клетки неповрежденными при высыхании. Количество трегалозы может достигать 20% сухой массы личинки.

Очевидно, что приспособления к ангидробиозу возникли у P. vanderplanki под действием естественного отбора. В местах его обитания засушливый сезон продолжается долго, личинки развиваются в пересыхающих лужах на скалах, а летает комар не особенно хорошо, поэтому не может мигрировать в более влажные районы. Российские и японские ученые уже много лет исследуют геномные детерминанты «суперспособности» P. vanderplanki. (Личинок комаров даже отправляли на МКС, где они благополучно регидратировались в условиях микрогравитации.) Кстати, способность переживать высыхание у беспозвоночных часто бывает ассоциирована с толерантностью и к другим экстремальным условиям.

В сентябре 2014 года исследователи опуликовали статью, в которой сравнили последовательности геномов P. vanderplanki и близкого вида P. nubifer, неспособного переживать засуху. Сравнение выявило кластер генов, играющих ключевую роль в ангидробиозе. Некоторые из этих генов, не характерные для других насекомых (например, шапероноподобные белки LEA), предположительно появились в геноме P. vanderplanki в результате горизонтального переноса переданы от почвенных бактерий.

В новой статьерегуляторные механизмы исследовали на линии клеток P. vanderplanki — Pv11. Эта линия тоже способна к ангидробиозу, который можно вызвать добавлением высоких концентраций трегалозы в среду. Авторы продемонстрировали, что в индукции ангидробиоза участвует повышение внутриклеточной концентраций ионов кальция, и идентифицировали вовлеченные в это сигнальные пути.

Ионы кальция, как внутриклеточный вторичный мессенджер, регулируют множество биологических процессов. Ключевые Ca 2+-зависимые сигнальные пути начинаются с белка кальмодулина, который связывает ионы кальция. В статье рассматривались два таких пути: «кальмодулин —кальциневрин —ядерный фактор активированных Т-клеток» (CaM-CaN-NFAT) и «кальмодулин — Ca 2+/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (CaMK) –– транскрипционный фактор CREB» (CaM-CaMK-CREB).

Авторы создали систему CRISPR- Cas9 редактирования генома для клеток Pv11 и с ее помощью ввели в клетки ген флуоресцентного индикатора кальция — GCaMP3 (метод knock-in). Это позволило визуализировать приток кальция в клетку. Оказалось, что обработка трегалозой вызывает кратковременное повышение концентрации Ca 2+ в цитоплазме клеток Pv11. Ингибирование сигнальных путей Ca 2+ во время обработки снижало выживание клеток после регидратации. Дальнейшие эксперименты показали, что путь «кальмодулин-кальциневрин-NFAT» способствует и толерантности к трегалозе, и толерантности к высыханию, в то время как путь «кальмодулин-кальмодулинкиназа»-CREB отвечает только за устойчивость к высыханию.

Таким образом, рост концентрации трегалозы индуцировал поступление ионов кальция внутрь клеток, а этот сигнал, в свою очередь, перенастроил активность генов через сигнальные пути.

На вопросы PCR.NEWS ответил один из авторов статьи Олег Гусев (Казанский федеральный университет, РФ, RIKEN, Япония):

Вы будете продолжать эксперименты с системой редактирования клеток P. vanderplanki? Что еще можно исследовать с ее помощью?

Основное «бутылочное горлышко» с немодельными организмами — это ограниченность экспериментальных методов, применимых к ним. С помощью системы редактирования клеток в Pv мы наконец-то сможем системно «выключать» гены, которые считаем ключевыми для выживания без воды и понять их «иерархию» в системе ангидробиоза. Это поможет окончательно определить ключевых игроков в системе молекулярного щита, защищающего клетки от смерти без воды.

Второе применение — это активное создание экспрессионных клеточных систем для синтеза нужных белков в клетках Pv11. Одну такую систему, которая синтезирует полимеразы и транскриптазы для мобильных генетических ПЦР-систем мы уже создали совместно с индустриальным партнером. Результат этой разработки применяется, например, в экспресс-ПЦР тестах, доступных в том числе и в московских аэропортах.

В вашей статье 2014 года упоминается, что у других беспозвоночных — тихоходок и других — ангидробиоз встречается у большого числа близкородственных видов, а P. vanderplanki такой один, у него нет родственников с ангидробиозом. Почему это делает его особо интересной моделью?

Идеальная модель для исследователя — это два контрастных состояния организма либо близкородственные организмы с резко отличающимися фенотипами. На этом построены, например, подходы к геномной селекции. В этом плане нам особенно повезло — хирономиды заселили всевозможные экстремальные экотопы, и адаптации поистине удивительны. В случае ангидробиоза ситуация вообще уникальная — он появился у единственного вида хирономид. Так как у нас в наличии данные о более чем десятке геномов хирономид, вычленение уникальных генетических черт Pv не встречающихся у других хирономид и насекомых в целом — прекрасное подспорье для выделения механизмов напрямую связанных с ангидробиозом.

Есть ли практические применения у исследований криптобиоза беспозвоночных?

Конечно! Из разряда самых известных и банальных — активное применение трегалозы во всевозможных молекулярных технологиях, связанных с генетикой. Изначально именно биомиметика ангидробионтов навела ученых на мысль использовать трегалозу в реакциях как стабилизатор. Наши собственные разработки дают клеточные системы экспрессии на основе Pv11 для продукции сложных белков. В ряде японских биобанков уже применяются протоколы для добавления трегалозы в смеси с LEA белками Pv, что снижает требования к глубокой заморозке клеток для длительного хранения. Кроме того, наш новый российско-японский проект РНФ сейчас напрямую направлен не только и не столько на понимание механизмов ангидробиоза, сколько на скрининг новых, еще не известных белков Pv и других ангидробионтов, использование которых позволит создавать клеточные культуры, способные хорошо себя чувствовать в более экстремальных по сравнению с обычными условиях. Это важно для усовершенствования рекомбинантного производства «сложных» белковых продуктов.

Теги
Биология
21 января, 2022
Биологи МГУ выяснили механизм полёта мельчайших жуков
Международная команда исследователей под руководством специалистов кафедры энтомологии биологическ...
18 января, 2022
Ученые выяснили, от чего зависит эффективность доставки лекарств в раковые клетки
С помощью везикул, отделяемых от мембран клеток, можно доставлять в раковые клетки уничтожающ...