Очевидно, что приспособления к ангидробиозу возникли у P. vanderplanki под действием естественного отбора. В местах его обитания засушливый сезон продолжается долго, личинки развиваются в пересыхающих лужах на скалах, а летает комар не особенно хорошо, поэтому не может мигрировать в более влажные районы. Российские и японские ученые уже много лет исследуют геномные детерминанты «суперспособности» P. vanderplanki. (Личинок комаров даже отправляли на МКС, где они благополучно регидратировались в условиях микрогравитации.) Кстати, способность переживать высыхание у беспозвоночных часто бывает ассоциирована с толерантностью и к другим экстремальным условиям.
В сентябре 2014 года исследователи опуликовали статью, в которой сравнили последовательности геномов P. vanderplanki и близкого вида P. nubifer, неспособного переживать засуху. Сравнение выявило кластер генов, играющих ключевую роль в ангидробиозе. Некоторые из этих генов, не характерные для других насекомых (например, шапероноподобные белки LEA), предположительно появились в геноме P. vanderplanki в результате горизонтального переноса переданы от почвенных бактерий.
В новой статьерегуляторные механизмы исследовали на линии клеток P. vanderplanki — Pv11. Эта линия тоже способна к ангидробиозу, который можно вызвать добавлением высоких концентраций трегалозы в среду. Авторы продемонстрировали, что в индукции ангидробиоза участвует повышение внутриклеточной концентраций ионов кальция, и идентифицировали вовлеченные в это сигнальные пути.
Ионы кальция, как внутриклеточный вторичный мессенджер, регулируют множество биологических процессов. Ключевые Ca 2+-зависимые сигнальные пути начинаются с белка кальмодулина, который связывает ионы кальция. В статье рассматривались два таких пути: «кальмодулин —кальциневрин —ядерный фактор активированных Т-клеток» (CaM-CaN-NFAT) и «кальмодулин — Ca 2+/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (CaMK) –– транскрипционный фактор CREB» (CaM-CaMK-CREB).
Авторы создали систему CRISPR- Cas9 редактирования генома для клеток Pv11 и с ее помощью ввели в клетки ген флуоресцентного индикатора кальция — GCaMP3 (метод knock-in). Это позволило визуализировать приток кальция в клетку. Оказалось, что обработка трегалозой вызывает кратковременное повышение концентрации Ca 2+ в цитоплазме клеток Pv11. Ингибирование сигнальных путей Ca 2+ во время обработки снижало выживание клеток после регидратации. Дальнейшие эксперименты показали, что путь «кальмодулин-кальциневрин-NFAT» способствует и толерантности к трегалозе, и толерантности к высыханию, в то время как путь «кальмодулин-кальмодулинкиназа»-CREB отвечает только за устойчивость к высыханию.
Таким образом, рост концентрации трегалозы индуцировал поступление ионов кальция внутрь клеток, а этот сигнал, в свою очередь, перенастроил активность генов через сигнальные пути.
На вопросы PCR.NEWS ответил один из авторов статьи Олег Гусев (Казанский федеральный университет, РФ, RIKEN, Япония):
Вы будете продолжать эксперименты с системой редактирования клеток P. vanderplanki? Что еще можно исследовать с ее помощью?
Основное «бутылочное горлышко» с немодельными организмами — это ограниченность экспериментальных методов, применимых к ним. С помощью системы редактирования клеток в Pv мы наконец-то сможем системно «выключать» гены, которые считаем ключевыми для выживания без воды и понять их «иерархию» в системе ангидробиоза. Это поможет окончательно определить ключевых игроков в системе молекулярного щита, защищающего клетки от смерти без воды.
Второе применение — это активное создание экспрессионных клеточных систем для синтеза нужных белков в клетках Pv11. Одну такую систему, которая синтезирует полимеразы и транскриптазы для мобильных генетических ПЦР-систем мы уже создали совместно с индустриальным партнером. Результат этой разработки применяется, например, в экспресс-ПЦР тестах, доступных в том числе и в московских аэропортах.
В вашей статье 2014 года упоминается, что у других беспозвоночных — тихоходок и других — ангидробиоз встречается у большого числа близкородственных видов, а P. vanderplanki такой один, у него нет родственников с ангидробиозом. Почему это делает его особо интересной моделью?
Идеальная модель для исследователя — это два контрастных состояния организма либо близкородственные организмы с резко отличающимися фенотипами. На этом построены, например, подходы к геномной селекции. В этом плане нам особенно повезло — хирономиды заселили всевозможные экстремальные экотопы, и адаптации поистине удивительны. В случае ангидробиоза ситуация вообще уникальная — он появился у единственного вида хирономид. Так как у нас в наличии данные о более чем десятке геномов хирономид, вычленение уникальных генетических черт Pv не встречающихся у других хирономид и насекомых в целом — прекрасное подспорье для выделения механизмов напрямую связанных с ангидробиозом.
Есть ли практические применения у исследований криптобиоза беспозвоночных?
Конечно! Из разряда самых известных и банальных — активное применение трегалозы во всевозможных молекулярных технологиях, связанных с генетикой. Изначально именно биомиметика ангидробионтов навела ученых на мысль использовать трегалозу в реакциях как стабилизатор. Наши собственные разработки дают клеточные системы экспрессии на основе Pv11 для продукции сложных белков. В ряде японских биобанков уже применяются протоколы для добавления трегалозы в смеси с LEA белками Pv, что снижает требования к глубокой заморозке клеток для длительного хранения. Кроме того, наш новый российско-японский проект РНФ сейчас напрямую направлен не только и не столько на понимание механизмов ангидробиоза, сколько на скрининг новых, еще не известных белков Pv и других ангидробионтов, использование которых позволит создавать клеточные культуры, способные хорошо себя чувствовать в более экстремальных по сравнению с обычными условиях. Это важно для усовершенствования рекомбинантного производства «сложных» белковых продуктов.
