Доктор биологических наук Оксана Семячкина-Глушковская, Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского
Гематоэнцефалический барьер — тонкая физиологическая организация — оставался вне поля зрения учёных до тех пор, пока не стало очевидно, что именно он тормозит успехи современной медицины и именно в его работе скрыты ресурсы для новой эпохи в фармакологии. За последние 20 лет в мире было синтезировано более 40 новых препаратов, из которых всего два — для лечения болезней мозга. Гематоэнцефалический барьер создаёт для некоторых веществ «зелёный» коридор, но для целого ряда препаратов он остаётся непроницаемым, и потому врачи безоружны в борьбе со многими неврологическими патологиями, такими, например, как инсульт мозга. Задача проницаемости барьера встала, когда было признано, что у новорождённых это заболевание встречается так же часто, как у взрослых.
Исследования проводились на биологическом факультете Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского в рамках проекта Российского научного фонда (№ 14-15-00128) и гранта Президента РФ (МД-2216.2014.4).
Десять лет назад диагноз «инсульт» детям ставили крайне редко. Сегодня прогресс в развитии безопасных технологий для внутреннего исследования мозга (визуализация) позволил исследователям увидеть серьёзность проблемы. Особенность детского инсульта в том, что он проходит зачастую бессимптомно или «маскируется» под другие заболевания. Последствия катастрофичны для ребёнка. У большинства маленьких пациентов возникают серьёзные нарушения: задержка умственного и речевого развития, гиперреактивность, затруднения в концентрации внимания, у них страдают логика и адаптация к стрессам, что не сразу и не очевидно проявляется в первые дни жизни.
Но диагностика инсульта мозга у новорождённых — лишь первый этап. Главный вопрос — как лечить и как предупредить это заболевание. Детский и взрослый инсульты — разные! Мы знаем, какие факторы провоцируют развитие инсульта у взрослых — к примеру гипертензия. Но для малышей эти факторы не так актуальны, и даже такие очевидные на первый взгляд причины, как родовые травмы, не вошли в лидирующую десятку провокаторов инсульта у детей.
Почему инсульты мозга у новорождённых и взрослых так различаются? После появления на свет мозг ребёнка ещё продолжает развиваться, причём особенно интенсивно в первые дни после рождения. В настоящий момент не существует тактики лечения инсульта мозга у новорождённых. Мало зная об этом заболевании у младенцев, врачи вынуждены применять к ним терапию, показанную для взрослых. Она оказывается неэффективной, а иногда даже мешает выздоровлению. Успех в лечении таких детей — зачастую случайность, а не результат заранее спланированной тактики врача.
Возникло предположение, что многие препараты, которые существуют в арсенале врача для лечения инсульта, просто не доходят до мозга новорождённого из-за капризного гематоэнцефалического барьера, который закрывается и не даёт поработать препаратам.
Несмотря на прорывные технологии в визуализации структур мозга, решения проблем детского инсульта не было, потому что не хватало подходящего инструментария для исследования «ворот», пропускающих лекарства в гематоэнцефалическом барьере.
В экспериментальной медицине платформа для изучения любых болезней — моделирование патологии на животных. Среди существующих на сегодняшний день моделей инсульта ни одна не пригодна для новорождённых.
Есть два типа инсульта — ишемический, когда сосуды мозга сужаются, что ограничивает его питание и кровоснабжение, и геморрагический, когда сосуды рвутся без явных на то причин. У новорождённых преобладает второй тип инсульта. Однако модели, традиционно применяемые для изучения геморрагического инсульта, работают по принципу механического введения крови в мозг экспериментальных животных, что сильно ограничивает исследовательские возможности.
На биологическом факультете Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского разработали модель инсульта, с помощью которой можно увидеть, как сосуды мозга разрываются самостоятельно, без дополнительных вмешательств. Для этого используется звуковой стресс (120 дБ, 7 Гц). Звуковые волны за счёт способности глубоко проникать в мозг нарушают центры регуляции его кровотока.
Сосудистые «катастрофы» у новорождённых случаются не сразу, а через два-три дня после рождения. Аналогичные изменения происходят с сосудами лабораторных животных после влияния звукового стресса. И хотя звук — это неадекватный провоцирующий фактор для детского инсульта, на сегодняшний день это единственная модель, которая позволяет изучать развитие данной патологии без инвазивных вмешательств, запуская внутренние патологические процессы, максимально приближенные к естественному ходу событий.
Появление голубого окрашивания тканей мозга у взрослой (справа) и у новорождённой (слева) крыс на фоне развития инсульта и введения красителя Evans blue.
Однако для взрослых животных простого стресса недостаточно, чтобы вызвать инсульт головного мозга. Для них требуется наличие хронически высокого артериального давления, изнашивающего сосуды и делающего их стресс-неустойчивыми. Для того чтобы изучать, как работает «барьер» на первых этапах жизни и на последующих этапах развития, мы вооружились современными методами флуоресцентного обнаружения белков окклудин и клаудин-5, работающих «таможенниками» на границе между мозгом и кровью. Воспользовались и старым методом изучения прохождения барьера красителем Evans blue (голубой Эванса), связывающимся с белками крови. Именно этот краситель в 1885 году помог открыть гематоэнцефалический барьер немецкому нейрофизиологу Паулю Эрлиху. Когда он ввёл краситель в кровь, то обнаружил, что все внутренние органы окрасились, а мозг нет. Позже опыты повторил его ученик Эдвин Голдман, но он вводил краситель уже непосредственно в спинномозговой канал лабораторного животного. Мозг становился синим, при этом вся краска оставалась в нём, не проникая на периферию. И по сей день краситель Evans blue — надёжный способ проверки работы гематоэнцефалического барьера. Конечно, появились и другие, более точные способы тестирования проницаемости барьера, например светящиеся метки, закреплённые на полисахаридах — декстранах разной массы (3 кДа и 70 кДа).
А теперь посмотрим, как работает гематоэнцефалический барьер при развитии геморрагического инсульта и как эти процессы отличаются друг от друга в первые дни после рождения лабораторного животного и в последующем его развитии.
Оказалось, внутривенное введение красителя крысам на фоне развития инсульта сопровождается появлением голубой окраски тканей мозга только у взрослых, но не у новорождённых особей.
Мы исследовали, какие вещества проходят через гематоэнцефалический барьер в условиях, когда организму необходимо бороться с инсультом. Для этого использовали флуоресцентные метки — лёгкие (декстран 3 кДа) и тяжёлые (декстран 70 кДа), которые своим свечением подсказывают нам их местонахождение и помогают определить путь движения.
Как оказалось, у взрослых крыс мозг при инсульте как решето: пропускает даже высокомолекулярные соединения (декстран 70 кДа). А у новорождённых декстрановые флуоресцентные метки застревают в сосудах: барьер закрывается так плотно, что даже низкомолекулярные соединения (декстран 3 кДа) остаются в пределах сосудов и не попадают в мозг.
Лёгкие флуоресцентные метки (декстран 3 кДа) распределены по-разному: у взрослой крысы (слева ) — распределение по всему мозгу, а у новорождённой (справа) — концентрирование в сосуде на фоне развития инсульта мозга.
Используя метод иммуноблоттинга (метод определения специфических белков), удалось увидеть белки, которые и делают барьер непроницаемым. Мы наблюдали за двумя критически важными белками — клаудином-5 и окклудином. У новорождённых крыс этих белков в разы больше, чем у взрослых. Вот почему краситель Evans blue и флуоресцентные метки у новорождённых особей «застревают» в барьере, в то время как у взрослых он становится более «лояльным» — проницаемым для веществ, которые в обычных условиях в мозг не попадают.
Возможно ли найти объяснение разного поведения мозга в момент его начального развития и когда статус организма уже сформировался? Мозг развивается по принципу избыточности. Он старается иметь сразу всё и много и только потом разбирается, что с этим делать. Часть его структур, к примеру адренергические нейроны, у которых медиаторами служат норадреналин и адреналин, образуется задолго до рождения, но созревает только к двум годам жизни. Другие структуры, альфа2-адренорецепторы, наоборот, созревают до рождения в огромном количестве, а после их плотность заметно снижается. Но так или иначе, многие молекулярные структуры мозга, равно как и его биохимия, формируются заведомо с избытком. Возможно, это одна из причин, почему у новорождённых наблюдается повышенная экспрессия «барьерных» белков, препятствующих проникновению многих «взрослых» препаратов, которые применяют при лечении инсульта мозга.
Экспрессия структурных белков гематоэнцефалического барьера — окклудина и клаудина-5 у новорождённых и взрослых крыс (более тёмные полоски отражают более высокую экспрессию).
Тайна гематоэнцефалического барьера — как грань между небом, землёй и воздухом. Его можно «увидеть», но трудно постичь. Нужны бойцы-невидимки, которые могли бы обмануть строгих стражей барьера, пронести необходимую «гуманитарную помощь» страдающему мозгу маленького пациента и помочь ему в борьбе с инсультом. Такими помощниками могут стать транспортные системы — липосомы, капсулы, углеродные нанотрубки, которые активно разрабатываются с этой целью во всём мире.
130 лет назад человечеству приоткрылся один из механизмов работы мозга: была обнаружена «перегородка» между мозгом и кровеносной системой тела — гематоэнцефалический барьер. Он состоит из нескольких слоёв: со стороны тела кровеносный капилляр мозга выложен клетками эндотелия на базальной мембране. Со стороны ткани мозга находится слой нейронов, так что они переплетаются в трёхмерную сеть. Такая структура позволяет регулировать проникновение из крови в мозг биологически активных веществ, метаболитов, но препятствует поступлению в мозг чужеродных веществ, микроорганизмов, токсинов.
