Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Для выполнений целей исследования: 1. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и лейкоцитов, его связи с хроническим перипубертатным воздействием химических веществ и качеством семени в проспективной когорте молодых мужчин, наблюдаемых с восьмилетнего возраста. 2. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и клеток печени, его связи с перинатальным воздействием промышленных ингибиторов горения (БДЭ-47) и качеством спермы в экспериментальной модели крыс в течение первого года научный коллектив, в первую очередь, сосредоточился на работе в лабораториях для подготовки образцов надлежащего качества, валидации протоколов выделения малой РНК, подготовки библиотек к последующей генерации профиля малой РНК в 4-х типах образцов с использованием масштабного параллельного секвенирования. Сформирована междисциплинарная международная команда исследователей на базе нескольких институтов, которая в ходе выполнения предыдущего проекта РНФ позволила успешно проделать запланированную работу по поиску молекулярных биологических маркеров воздействия промышленных химических веществ на геном репродуктивных клеток и фертильность у мужчин (проект РНФ 14-45-00065), включающая в себя: эпигенетического эпидемиолога, являющегося экспертом в области эпигеномики сперматозоидов (Проф. Ричард Пилзнер, Университет Массачусетса, Амхерст, США); токсиколога-биолога, эксперта изучения молекулярных механизмов воздействия химических веществ на организм животных (Проф. Александр Суворов, Университет Массачусетса, Амхерст, США); эпидемиолога, изучающего влияние химических веществ на репродуктивное здоровье и эпигеном, мирового лидера в этой области, директора Департамента окружающей среды и здоровья Гарвардской школы общественного здоровья, США (Проф. Расс Хаузер (консультант); руководителя лаборатории – лидера изучения малых некодирующих РНК сперматозоидов, авторов протоколов выделения мнк РНК из спермотозоидов с последующим секвенированием и биоинформатическим анализом (Проф. Стефен Кравец, Университет Вейна, США); репродуктивного эндокринолога и эпидемиолога, являющегося российским PI Russian Children’s Study -Др. Олег Сергеев (НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, Россия); молекулярных биологов-генетиков с большим опытом лабораторной работы на современной приборной базе NGS (Мария Логачева (консультант), Виктория Штратникова, Василий Ашапкин, Анна Желудкевич - НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, Россия); биоинформатиков, специализирующихся на методах, применяемых в эпигенетике – Евгений Герасимов (МГУ), Александр Шершебнев, Юлия Медведева (ИОГен РАН, Россия), Юлия Корниенко – Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург. Закуплено необходимое оборудование и расходные материалы, включая 2 морозильника для хранения образцов и реагентов, среды для фракционирования сперматозоидов в градиенте плотности, гомогенизатор и стальные шарики для гомогенизации сперматозоидов, наборы Qiagen RNeasy Mini Kit для выделения малой и общей РНК, наборы Qubit™ microRNA, Qubit™ dsDNA HS, Qubit™ RNA HS для количественного определения микро РНК, ДНК и РНК, соответственно; наборы для приготовления библиотек малых РНК (NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina - предназначенные для образцов сперматозоидов и печени крыс и NEXTflex® Small RNA-Seq Kit v3 - для образцов лейкоцитов и сперматозоидов человека); наборы для контроля качества процедур выделения малых РНК и подготовки библиотек Agilent Small RNA kit, Agilent High Sensitivity DNA Kit, Agilent RNA Pico 6000 Kit; набор для очистки продуктов ПЦР AMPure XP, праймеры для процедур контроля качества; набор реагентов для секвенирования NextSeq® 500/550 High Output Kit v2 (75 циклов) 140 библиотек с рекомендованным минимальным количеством ридов; ДНКаза, RNase Block Ribonuclease Inhibitor и другие наборы, реагенты, пробирки и расходные материалы. С учетом того, что данный проект является продолжением предыдущего проекта РНФ (14-45-00065), где в тех же образцах изучались профили метилирования ДНК, важно было получить библиотеки надлежащего качества из аликвот тех же образцов, которые использовались для RRBS. В случае с образцами семени человека это являлось нетривиальной задачей. Вместе с тем, научному коллективу удалось фракционировать 38 образцов из 51 с выходом достаточного количества сперматозоидов (не менее 12 миллионов) от 34 участников исследования для последующего выделения общей и малой РНК в достаточном для библиотек количестве. В результате отработки и валидизации протокола выделения мнкРНК из образцов лейкоцитов мужчин с использованием 36 дискардных замороженных\размороженных и свежих образцов был получен протокол, который использовался для образцов исследования (Приложение 1). В ходе использования данного протокола на 43 образцах лейкоцитов мужчин медианные значения миРНК (25-75 процентили), оцененной с помощью Qubit miRNA assay, составили 8.0 (3.3-13.4) нг/мкл. Выход миРНК составил 63.1 (36.8-150.7) нг/10*9 лейкоцитов. Подобный протокол (Приложение 4) был разработан для сперматозоидов (на основе 17 дискардных образцов). В ходе использования данного протокола на 38 образцах сперматозоидов мужчин медианные значения миРНК (25-75 процентили), оцененной с помощью Qubit miRNA assay, составили 0.91 (0.55-10.75) нг/мкл. Выход миРНК составил 1.34 (0.68-7.7) нг/миллионов сперматозоидов. Валидированный с использованием 16 дискардных образцов протокол для печени крыс (Приложение 5) позволил получить на 12 образцах исследования медианные значения миРНК (25-75 процентили), оцененной с помощью Qubit miRNA assay, 448 (400-579) нг/мкл. Для оценки валидности протоколов и качества полученных сиквенсов были проведены пробные секвенирования 10 дискардных образцов печени крыс, 1 образца сперматозоидов крыс, 8 дискардных образцов лейкоцитов человека и 3 дискардных образцов сперматозоида человека на NextSeq 500 Illumina с последующим биоинформатическим анализом. Для абсолютного большинства образцов наблюдается высокий процент картирования чтений на геном (около 95%, из которых более 50% картируется в более, чем одно положение, что в целом характерно для чтений микроРНК). Однако распределение картированных чтений по категориям оказывалось довольно разным в разных пилотных образцах. Можно выделить группы образцов, которые оказались богатыми тРНК, рРНК или piwi-РНК. В целом в образцах РНК из лейкоцитов категория "микроРНК" оказывается самой представленной (от 48% чтений и выше). Анализ представленности топ 200 миРНК (примерно 15% от картированных миРНК) для 6 лейкоцитарных образцов показал большое количество пересечений (150 из 200) миРНК (рисунок 6X), что может свидетельствовать о применимости разработанных методов для анализа миРНК лейкоцитов. Библиотеки мнк РНК 36 образцов крыс (12 образцов сперматозоидов на 65-й постнатальный день, 12 образцов сперматозоидов на 120-й постнатальный день и 12 образцов печени на 120-й постнатальный день) были подготовлены из всех образцов с использованием набора NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina®. Концентрации мнкРНК были измерены в общей РНК перед подготовкой библиотек и составили в среднем 105 нг/мл в образцах сперматозоидов и 485 нг/мл в образцах печени. Все 36 образцов крыс были секвенированы на NextSeq® 500 секвенаторе с использованием набора NextSeq® 500/550 High Output Kit v2 (75 циклов). Библиотеки лейкоцитов 43 участников исследования подготовлены для секвенирования. Научный коллектив продолжит работу над оптимальной подготовкой библиотек сперматозоидов, применяя методику предварительного пробного секвенирования для расчёта количества необходимых чтений при полномасштабном секвенировании, и намерен провести секвенирование 43 лейкоцитарных и 38 сперматозоидных образцов в отдельных полных прогонах на NextSeq 500 Illumina в декабре 2018-январе 2019. Сформирована информационная база данных 51 участника исследования, отобранного для данного эпигенетически-эпидемиологического проекта. Описание переменных перипубертатной экспозиции химическими веществами и различных ковариат, включающих факторы образа жизни (в т.ч. курение и питание), антропометрические показатели, показатели репродуктивного здоровья и качества семени, представлено в Приложении 11. Информация о метилировании ДНК сперматозоидов представлена для 2,6 млн CpG с покрытием не менее 10X для 34 участников исследования. В текущем году исследование было представлено устными докладами на трех международных конференциях, в которых рассказывалось о результатах предыдущего исследования в рамках гранта РНФ (14-045-00065) и о дизайне текущего исследования: Во время приезда участников научного коллектива проф. Александра Суворова и проф. Ричарда Пилзнера в НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского были проведены семинары под общим названием “Environmental exposure and sperm epigenetics. A pathway for intergenerational inheritance?”

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
У проекта заявлены следующие цели: 1. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и лейкоцитов, его связи с хроническим перипубертатным воздействием химических веществ и качеством семени в проспективной когорте молодых мужчин, наблюдаемых с восьмилетнего возраста. 2. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и клеток печени, его связи с перинатальным воздействием промышленных ингибиторов горения (БДЭ-47) и качеством спермы в экспериментальной модели крыс. В течение второго года научный коллектив, в первую очередь, сосредоточился на досеквенировании с целевым количеством чтений библиотек малых некодирующих РНК сперматозоидов и лейкоцитов человека, а также на биоинформатическом и биостатистическом анализе дифференциально экспрессируемых малых РНК в зависимости от разных факторов у людей и в зависимости от возраста и от воздействия токсичного ингибитора горения – у крыс. Всего было приготовлено более 80 библиотек сперматозоидов и 72 библиотеки лейкоцитов человека, были получены данные 53 сиквенсов лейкоцитов и 90 сиквенсов сперматозоидов. Для решения проблемы низкого содержания и выхода малых РНК сперматозоидов был предпринят дополнительный эксперимент с попарным приготовлением библиотек, используя два коммерческих набора: NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® и набор Biooscientific NEXTflex® Small RNA-Seq Kit v3. Были получены неоднозначные результаты эксперимента, по итогам которого готовится публикация. Учитывая использование набора от Biooscientific для получения данных малых РНК в лейкоцитах, а также на основании недавно опубликованной статьи с результатами другого эпигенетического эпидемиологического исследования наших коллег и консультантов (Estill et al., 2019), в котором также использовался набор Biooscientific, было принято решение в пользу данного набора для библиотек сперматозоидов человека. После объединения технических репликат данные малой лейкоцитарной РНК 42 участников исследования были включены в последующие анализы. В среднем было получено 15.4 миллионов чтений на образец (от 5.2 до 30.7 миллионов). Среднее выравнивание на геном составило 96.0% (от 86.4 до 98.3%). Для сперматозоидов человека, с учетом крайне малого содержания в них малой некодирующей РНК, 0.3 фг в клетке (0.3 10-15г), был установлен порог в 18000 чтений, картированных на миРНК на образец. Данному критерию удовлетворяли образцы сперматозоидов 17 участников исследования. Библиотеки образцов крыс готовились с помощью набора NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina®. 12 библиотек печени крыс были секвенированы со средним выходом 13,4 миллионов чтений на образец. 24 образцов сперматозоидов крыс, включая 6 контрольных, собранных на постнатальный день 65 (ПНД 65), 6 контрольных, собранных на ПНД 120, 6 от экспонированных крыс, собранных на ПНД 65; и 6 от экспонированных крыс, собранных на ПНД 120, были секвенированы с минимальным количеством чтения 1.5 миллиона на образец. После проведенного литературного поиска научный коллектив апробировал несколько биоинформатических подходов, используемых для количественной оценки малых некодирующих РНК, полученных с помощью NGS. Для сравнения мы использовали данные, полученные в ходе наших исследований и данные, полученные другими коллективами. Итоговый биоинформатический протокол был использован для всех типов клеток человека и крыса. Мы использовали два подхода для подсчета количества прочтений, сопоставленных с последовательностями малых некодирующих РНК: картирование на весь геном и картирование на отдельные последовательности малых некодирующих РНК. В обоих подходах мы использовали bowtie в качестве основного выравнивателя для картирования, samtools для манипулирования данными SAM/BAM и BEDtools для подсчета выровненных прочтений. Для картирования на весь геном мы использовали версию hg38 для чтений человека и rn6 Rattus norvegicus для чтений крысы в сочетании с RNAcentral v16, файлом базы данных некодирующей последовательности РНК. Для отдельного картирования использовались следующие базы данных: miRBase v22 для микроРНК, piRNAdb v1.7.5 для piRNA, GtRNAdb v18.1 для тРНК, SILVA v132 для рибосомальной РНК и UNIVEC для возможных загрязнителей. В случае отдельного выравнивания прочтения сначала выравнивались на базу UniVec, некартированные прочтения - на базу рибосомальных РНК, а все оставшиеся считывания последовательно сопоставлялись с базами данных микроРНК, пиРНК и тРНК. Был получен профиль малой РНК в лейкоцитах 42 и сперматозоидах 17 здоровых мужчин возрастом 18,6±0,4 лет, представляющих собой выборку из 51 участника когорты мальчиков\подростков\молодых мужчин одного города, наблюдавшихся с 8-9 летнего возраста. С покрытием более 10 было обнаружено 712 миРНК и прекурсоров миРНК, 423 piРНК и 317 tРНК (общее количество 1452) в лейкоцитах; и 334 миРНК и прекурсоров миРНК, 971 piРНК и 333 tРНК (общее количество 1638) в сперматозоидах мужчин. При сравнении прочтений и представленности малых некодирующих РНК в лейкоцитах и сперматозоидах можно отметить, что для лейкоцитов среднее количество чтений топ-20 практически на два порядка больше по миРНК (240872 и 3363), на один порядок больше по piРНК (78852 и 5170), однако меньше по tРНК (3870 и 11396), чем для сперматозоидов. Чтения малой некодирующей РНК были подвергнуты нормализации с помощью встроенного алгоритма VST в пакете DESeq2, который использовался для поиска дифференциальной экспрессии в зависимости от различных факторов в регрессионных моделях. На первом этапе использовались однофакторные модели зависимости профиля экспрессии малой РНК от набора из 52 ковариат, отдельно для лейкоцитов, отдельно для сперматозоидов. Набор ковариат включал факторы химической экспозиции, образа жизни, перинатальной истории, социально-эконномические, антропометрические, лейкоцитарный состав, курение, технические параметры пробоподготовки. В случае выявления большого количества дифференциально экспрессированных малых РНК в зависимости от какого-либо фактора, данный фактор затем включался в многофакторную модель в качестве ковариаты. Так, многофакторная модель для малых РНК лейкоцитов включала такие значимые факторы, как возраст матери при родах, образование родителей, процент калорий в день, получаемых мальчиком из белка на момент вовлечения в исследование (8-9 лет), индекс массы тела на момент сдачи образцов, курение в течение последних шести месяцев, клеточный состав лейкоцитов, концентрация миРНК после выделения и батч секвенирования Были выявлены дифференциально экспрессированные малые РНК в зависимости от перипубертатной экспозиции самого токсичного конгенера диоксинов, ТХДД. Данная зависимость была обнаружена как в лейкоцитах (в однофакторной и многофакторных моделях, стандартизированных на ковариаты-конфаундеры), так и в сперматозоидах человека. Так, в многофакторной модели была выявлено 151 значимо дифференциально экспрессируемая в лейкоцитах малая РНК, 106 из которых имело положительную, а 45 отрицательную связь, при уровне значимости p<0.001 с коррекцией на fdr <0.1. Была найдена также связь содержания свинца в период перипубертата и профиля малой РНК лейкоцитов в 18 лет. В однофакторном анализе были выявлены 19 значимо дифференциально экспрессируемых малых РНК в лейкоцитах, 9 из которых с положительной, а 10 с отрицательной связью, при уровне значимости p<0.001 с коррекцией на fdr <0.1. Анализ возрастных изменений в мнРНК сперматозоидов крыс выявил 67 микро-РНК, 17 piРНК и 91 тРНК, диффернциально экспрессированных у контрольных крыс между 65-ым и 120-ым постнатальными днями. Такое же сравнение экспрессии мнРНК у экспонированных животных позволило определить 59 значительно измененных микро-РНК, 24 piРНК и 42 тРНК. Возрастные изменения мнРНК частично пересекаются между контрольными и экспонированными группами животных. Так, 26 микро-РНК и 26 тРНК были значимо изменены в зависимости от возраста крыс в обоих группах. Только 1 piРНК была изменена в обоих группах. Перинатальная экспозиция БДЭ-47 не вызвала изменений в экспрессии мнРНК у молодых животных (постнатальный день 65), в то время, как у животных старшего возраста (постнатальный день 120) была изменена экспрессия 14 микро-РНК. Этот анализ демонстрирует ранее описанный феномен "программирования" ранними экспозициями ксенобиотиков, когда у молодых животных не обнаруживаются фенотипические эффекты, но они "проявляются" в более позднем возрасте. Подобные эффекты программирования на эпигеном сперматозоидов не были описаны ранее. Анализ влияния перинатальной экспозиции БДЭ-47 на изменение профиля малой РНК печени крыс продемонстрировал изменения в молекулярных каскадах, ответственных за инсулиновый сигналинг, диабет второго типа и стеатоз печени. Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что экспозиция крыс БДЭ-47 на ранних этапах развития меняет эпигеном печени таким образом, что может влиять на метаболизм жиров и углеводов. Эти результаты полностью соответствуют ранее описанным эффектам БДЭ-47 на метаболический профиль организма и позволяют идентифицировать эпигенетические механизмы в качестве механизмов, ответственных за долгосрочное поддержание аберрантного метаболического фенотипа печени. В текущем году исследование было представлено докладами на трех международных конференциях, в которых рассказывалось о результатах предыдущего исследования в рамках гранта РНФ (14-045-00065) и о дизайне и ходе текущего исследования: «Краеугольные аспекты репродуктивной медицины» (КАРМ-VII), июнь, Москва; международный семинар по молекулярной андрологии, сентябрь, Гессен, Германия; XXIX международная конференция Российской ассоциации репродукции человека (РАРЧ) 2019 “Репродуктивные технологии сегодня и завтра», сентябрь, Ростов. Во время приезда участников научного коллектива проф. Александра Суворова и проф. Ричарда Пилзнера в НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского в июне 2019 г. были проведены семинары под общим названием “Environmental exposure and epigenetic markers: non coding RNA and DNA methylation”.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В течение третьего года проекта научный коллектив завершил решение поставленных задач и добился заявленных целей и результатов. В рамках молекулярно-токсикологического эксперимента научный коллектив сравнил возраст-ассоциированные изменения профиля мнкРНК в сперматозоидах крыс, а также изучил влияние на эти изменения экспозиции загрязнителем окружающей среды, бромированным антипиретиком БДЭ-47. Результаты опубликованы в статье «Aging induces profound changes in sncRNA in rat sperm and these changes are modified by perinatal exposure to environmental flame retardant» журнала «International Journal of Molecular Sciences». График-схема полученных находок представлена на рисунке 6. Исследование показало, что у контрольных животных очень большое количество мнкРНК (1384) значимо меняет экспрессию в зависимости от возраста. В то же время экспозиция БДЕ-47, на первый взгляд, подавляет эти изменения (165 значимо возраст-зависимых мнкРНК). При более глубоком анализе мы обнаружили, что химическая экспозиция "ускоряет" возраст-зависимые изменения профиля малой РНК у молодых животных и "тормозит" у зрелых. Таким образом, профили малой РНК у молодых и зрелых экспонированных животных становятся более похожими друг на друга, чем таковые у контролей. Интересно, что анализ метилирования ДНК у тех же животных, выполненный в рамках предыдущего проекта РНФ (14-45-00065) нашей группой, выявил те же закономерности. Эта работа «Aging-induced changes in sperm DNA methylation are modified by low dose of perinatal flame retardants» была опубликована в журнале «Epigenomics”, и в ней наш научный коллектив впервые в мире продемонстрировал сопряженные возраст-ассоциированные изменения как в метиломе ДНК, так и в профиле мнкРНК сперматозлидов (Pilsner et al., 2020). Также мы обнаружили, что миРНК, претерпевающие наиболее существенные возрастные изменения у крыс в нашем исследовании (mir34с, mir449а, mir122), являются маркерами мужского бесплодия у человека. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эпигеном сперматозоидов претерпевает существенные возрастные изменения, которые могут сказываться на мужской фертильности, и нормальное течение этих возрастных изменений может быть нарушено химическими экспозициями. Наше исследование демонстрирует на крысиной модели, что возраст отца является исключительно важным фактором, определяющим профиль малой РНК в сперматозоидах. Возраст-зависимая малая РНК участвует в регулировании раннего эмбрионального развития, а также является биомаркером мужской фертильности. Для валидации метода и результатов масштабного параллельного секвенирования малой РНК методом ПЦР в реальном времени были использованы 3 значительно дифференциально экспрессированные миРНК в два возрастных периода сперматозоидов крыс (mir34с-5p, mir449а-5p, mir122-5p). В целом, результаты ПЦР в реальном времени подтвердили результаты секвенирования (рис. 5). В рамках эпигенетически-эпидемиологического исследования коллектив успешно решил в 2020 году методическую проблему малого выхода РНК из малого начального количества сперматозоидов человека. Для этого был проведен ряд дополнительных экспериментов, используя дополнительные аликвоты сперматозоидов, полученные после дополнительного фракционирования (n=17), дополнительного выделения РНК (n=14), дополнительной подготовки библиотек (n=29) и дополнительных сиквенсов (n=51, всего 134 за три года) в трех дополнительных прогонах на NextSeq 500. В результате протокол выделения РНК и подготовки библиотек был оптимизирован, и включает в себя отказ от использования какой бы то ни было ДНКазы, использование набора NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® с последующим удалением димеров адаптеров на геле с полигалактомананновыми добавками. Результаты изложены в поданной статье в Systems Biology in Reproductive Medicine "Optimization of small RNA extraction and comparative study of NGS library preparation from low count sperm samples" и доложены на 12 международном конгрессе по Андрологии-2020 (https://andrology2020-digital.de/). Оптимизированная методика позволила получить профили мнкРНК с должным качеством >=50 000 ридов после тримминга и выравнивания на геном (Estill et al., 2019), для образцов сперматозоидов с их низким количеством, и тем самым включить в анализ образцы 49 молодых мужчин из 51 возможных. Научным коллективом впервые в мире описан профиль малой РНК, включая миРНК, пиРНК и фрагменты тРНК, среди 42 образцов лейкоцитов и 49 образцов сперматозоидов молодых мужчин, с попарным профилем у 40 здоровых мужчин. В попарном датасете профиль мнкРНК лейкоцитов состоял из 1458 мнкРНК, включая 264 зрелых миРНК и 447 прекурсоров миРНК, 427 пиРНК и 320 фрагментов тРНК со средним количеством каунтов в матрице более 10. Профиль мнкРНК сперматозоидов включал 2265 мнкРНК (136 зрелых миРНК и 234 прекурсоров миРНК, 1546 пиРНК и 349 фрагментов тРНК со средним количеством каунтов в матрице более 10). Подтверждена клеткоспецифичность профилей мнкРНК при сравнении профилей сперматозоидов и лейкоцитов, из общего количества 3021 мнкРНК, представленных или в сперматозоидах или лейкоцитах одних и тех же мужчин, только 702 мнкРНК (23%) были общими. Коэффициент корреляции Спирмена между экспрессией всех мнкРНК в парах сперматозоидов и лейкоцитов составил 0.1-0.3 (рис. 3), а отдельно для миРНК он был несколько выше, 0.1-0.5 (рис. 4). Научный коллектив впервые в мире получил результаты взаимосвязи параметров качества семени с профилем мнкРНК среди 49 здоровых мужчин молодого возраста. Эти результаты были доложены в устном докладе на 12 международном конгрессе по Андрологии-2020 (https://andrology2020-digital.de/). В качестве интегрального параметра, характеризующего качество семени, был выбран показатель «Общее количество прогрессивно подвижных сперматозоидов», включающий характеристику объема эякулята, концентрации сперматозоидов и количества прогрессивно подвижных сперматозоидов. Обнаружено 102 мнкРНК, значимо дифференциально экспрессированных в зависимости от общего количества прогрессивно подвижных сперматозоидов, p-value, FDR adjusted <0.05 (Таблица 3). Функциональный анализ дифференциально экспрессированных 5 миРНК и связанных с ними 1282 потенциальных мишеней - белок-кодирующих генов, показал высоко значимые (-log10(P)>10) биологические категории, связанные с эмбриональным развитием, ответом на факторы роста и гормоны (рис. 7). Научный коллектив провел однофакторный и многофакторный регрессионный анализ профиля мнкРНК в зависимости от комплекса факторов химической экспозиции, социально-экономических факторов и факторов образа жизни, гормональных показателей, а также технических параметров пробоподготовки (всего более 80, таблица 1). Выявлены факторы, значительно влияющие на профиль мнкРНК (например, лейкоцитарный состав – на профиль мнкРНК в лейкоцитах; тип набора пробоподготовки и использование ДНКазы – на профиль мнкРНК в сперматозоидах). Данные факторы были включены с качестве ковариат в многофакторные модели. Впервые в мире проведен масштабный анализ зависимости профиля мнкРНК как отдельно в сперматозоидах и лейкоцитах мужчин, так и сопряженные изменения в двух типах клеток в зависимости от перипубертатной экспозиции широким спектром хлорорганических соединений, включая самый токсичный конгенер диоксинов, 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксин (ТХДД), суммарную концентрацию по группам химикатам (диоксины, фураны, диоксиноподобные ПХБ, недиоксиноподобные ПХБ), суммарный диоксиновый эквивалент (ДЭ). С учетом недавних находок о связи хлорорганических пестицидов с качеством семени, опубликованных нашим научным коллективом в журнале «Environmental International” в статье «"Peripubertal serum concentrations of organochlorine pesticides and semen parameters in Russian young men» (Abou Ghayda et al., 2020) отдельно проанализирован профиль мнкРНК сперматозоидов и лейкоцитов в зависимости от пестицидов и их метаболитов, таких как гексахлорбензол (ГХБ), гексахлорциклогексан (ГХЦГ) и дихлордифенил дихлорэтилен (ДДЭ). Также отдельно были получены результаты по влиянию перипубертатной экспозиции свинцом на профиль мнкРНК у мужчин молодого возраста. Более того, получены результаты по сопряженным изменениям профиля мнкРНК и метилома ДНК в лейкоцитах и сперматозоидах одних и тех же мужчин в зависимости от экспозиции химическими веществами: хлорорганическими соединениями и свинцом. Для поиска связанных геномных регионов с дифференциально метилированными CpG в нашем исследовании, использовался пакет annotatr, а для дифференциально экспрессированных миРНК – miRDbase. В результате были составлены списки белок-кодирующих генов для каждого из четырех датасетов (мнкРНК лейкоцитов, мнкРНК сперматозоидов, CpG лейкоцитов, CpG сперматозоидов) и выявлены списки генов, присутствующих во всех 4 датасетах для изучаемых факторов экспозиции. Так, для экспозиции самым токсичным конгенером ТХДД, было обнаружено 14 генов, суммарными диоксинами – 14, хлорорганическим пестицидом ГХБ – 175, а свинцом – 16. Обнаружен один ген, SIX1 (sine oculis homeobox 1), имеющий отношение к воздействию экспозицией всеми рассматриваемыми хлорорганическими соединениями. В литературе данный ген описан как онкоген, его экспрессия значительно увеличивается при развитии многих видов карцином. Описаны некоторые миРНК, для которых SIX1 является мишенью, в частности, miR-140-5p, а по результатам нашего исследования mir-140-precursor и miR-140-3p значимо дифференциально экспрессированы в сперматозоидах в зависимости от экспозиции ТХДД. Результаты функционального анализа демонстрируют связь экспозиции хлорорганическими соединениями со многими процессами эмбрионального развития и органогенеза (рис. 9, 10, 11). Таким образом, впервые в мире показаны сопряженные изменения профиля мнкРНК и метилома как сперматозоидов, так и лейкоцитов человека, под действием химических токсикантов в перипубертатном периоде, связанные с процессами эмбрионального развития и органогенеза. Особенную роль имеют выявленные изменения в сперматозоидах, которые несут эпигенетическую информацию последующему поколению. Наш научный коллектив следует современной концепции отцовских первопричин здоровья и болезней (англ. Paternal Origins of Health and Disease, POHaD), основанной на научных данных, говорящих о том, что воздействие факторов окружающей среды на отца может играть роль в репрограммировании здоровья следующего поколения на протяжении всей жизни, а возникшие изменения могут быть переданы через поколения посредством сложных и разнообразных эпигенетических механизмов. Опубликована обзорная статья (Sergeyev & Nikitin, 2019) на эту тему, написана обзорная статья о «Возраст-ассоциированных изменения эпигенома сперматозоидов».