Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Целью настоящего проекта является разработка комплекса новых технологий, использующих метод опыт-зависимой Cre-Lox модификации генома нейронов для введения генетически кодируемых оптических сенсоров и/или актуаторов в клетки специфической когнитивной сети мозга животного. При этом фоточувствительные молекулы, экспрессирующиеся в нейронах соответствующего когнитивного ансамбля, должны позволять исследовать и направленно управлять поведением данной клеточной сети методами нейрофотоники и оптогенетики. В 2017 году выполнялись этапы разработки одной из таких технологий - направленной экспрессии генетически кодируемых кальциевых сенсоров в Cre-Lox захваченных нейронных сетях мозга мышей для исследования их клеточной активности. С этой целью нами была получена двойная трансгенная линия мышей Fos-Cre-GCaMP3 за счет скрещивания мышей линий B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J и Ai38 RCL-GCaMP3. ДНК этих битрансгенных мышей содержит участок, соответствующий GCaMP3 (226 н.о.), и участок, соответствующий Fos-Cre (293 н.о.). В настоящее время полученная линия успешно ведется, трансгенных мышей сохраняют в гетерозиготной форме и скрещивают с мышами линии C57BL/6. Для оценки временной динамики экспрессии GCaMP3 в нейронах коры головного мозга мышей этой битрансгенной линии проводили прижизненную двухфотонную визуализацию одной и той же области теменной ассоциативной коры каждый день в течение 7 дней после эпизода Cre-рекомбинации, вызванной обучением в задаче условно-рефлекторного замирания на фоне инъекции тамоксифена. Было установлено, что максимальная экспрессия и накопление GCaMP3 в нейронах, вовлекавшихся в когнитивный эпизод, происходит на третий день после эпизода Cre-рекомбинации, и сохраняется в дальнейшем, что позволяет установить срок в три дня после эпизода Cre-рекомбинации как оптимальный для использования этой линии животных с целью исследования кальциевой активности в сети когнитивно-идентифицированных нейронов. С помощью метода прижизненной двухфотонной микроскопии были получены трехмерные изображения ассоциативной коры животных данной битрансгенной линии и выявлено количество нейронов в стеке двухфотонного изображения коры, прошедших Cre-Lox рекомбинацию. В пределах глубины визуализации метода прижизненной двухфотонной микроскопии максимальное количество GCaMP3-положительных нейронов было выявлено на глубине 100-170 мкм, что соответствует II/III слою ассоциативной коры. При визуализации GCaMP3 были выявлены тела и отростки нейронов, наибольшая часть нейронов имела протяженные дендритные отростки, идущие от тела нейрона к I слою неокортекса, на глубине 5-20 мкм были визуализированы дендритные ветви нейронов с отдельными шипиками. Битрансгенная линия Fos-Cre-GCaMP3 мышей была также охарактеризованы со стороны их поведенческого фенотипа, что было необходимо, чтобы выяснить отсутствие изменений поведения, обучения и возможности формировать память у гетерозиготных животных с knock-in мутацией эндогенного гена c-fos, в норме участвующего в процессах консолидации памяти. Было показано, что данные мыши не имеют нарушений в моторной координации в тесте «ротарод», не имеют повышения общего уровня тревожности в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» и имеют нормальные показатели исследовательской активности и повышенную двигательную активность в тесте «открытое поле». Отдельно была исследована способность битрансгенных мышей Fos-Cre-GCaMP3 к формированию и поддержанию долговременной памяти в модели условно-рефлекторного замирания, которая будет использоваться как основная модель формирования памяти в данном проекте. Было установлено, что что формирование и воспроизведение памяти в использованной модели у мышей битрансгенной линии не отличается от стандартной контрольной линии животных. Далее была проведена прижизненная двухфотонная визуализация динамики сигнала кальциевого сенсора GCaMP3 в нейронах ассоциативной коры в ответ на предъявление условного сигнала, использованного за 3 суток до этого у этих же животных в обучении. Были зарегистрированы значения увеличения GCaMP3 активности и идентифицированы три типа нейронов париетальной ассоциативной коры: в которых экспрессия GCaMP3 не изменялась в течение регистрации, нейроны, демонстрирующие кальциевую активность в отсутствии звукового условного сигнала и нейроны, демонстрирующие кальциевую активность во время предъявления звукового условного сигнала. Таким образом, в ходе работ 2017 года была получена и разнопланово охарактеризована двойная трансгеннная линия мышей Fos-Cre-GCaMP3, позволяющая идентифицировать в головном мозге нейроны, активировавшиеся во время выполнения животными когнитивной задачи во временном окне Cre-Lox рекомбинации. Данная линия трансгенных мышей демонстрирует нормальное поведение, обучение и память и может быть использована в качестве нового инструмента исследований кальциевой активности в популяции нейронов, генетически маркированных по их участию в специфической когнитивной деятельности. В 2018 году планируется разработка второй новой технологии на основе опыт-зависимой Cre-Lox модификации генома нервных клеток - направленной экспрессии в Cre-Lox захваченных нейронных сетях генетически кодируемых белков светочувствительных ионных каналов, позволяющих оптогенетически управлять активностью данных нейронов. Для этого будет получена и вестись новая двойная трансгенная линия мышей, получаемые скрещиванием линий B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J и B6;129S-Gt(ROSA)26Sor_tm32(CAG-COP4_H134R_EYFP)Hze_J (Fos-Cre-ChETA). Эта линия мышей, также, как и полученная в 2017 г. битрансгенная линия Fos-Cre-GCaMP3, будет охарактеризована в плане нейронального и поведенческого фенотипа, а также функциональных эффектов оптогенетической стимуляции.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В соответствии с общей логикой проекта в 2018 году нами решались два класса задач –нейротехнологические, по разработке и валидации новых методов исследования когнитивных клеточных сетей головного мозга; и научные, использующие данные технологии для изучения фундаментальных клеточных механизмов ассоциативной памяти. Технологическая часть проекта в 2018 году была связана с созданием, ведением, исследованием и апробацией в экспериментах битрансгенной линии мышей B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J-B6;129S-Gt(ROSA)26Sor_tm32(CAG-COP4_H134R_EYFP)Hze_J, (далее Fos-Cre-ChETA) позволяющей осуществлять направленную оптогенетическую стимуляцию нейронов мозга, маркированных Cre-Lox рекомбинацией в момент приобретения животным нового опыта. В рамках этой части работы нами была получена двойная трансгеннная линия мышей Fos-Cre-ChETA за счет скрещивания мышей линий R26-CAG-LSL-2XChETA-tdTomato и Fos-CreER. В результате генотипирования этих мышей выявлено, что их ДНК содержит участок, соответствующий Fos-Cre (293 bp). В настоящее время полученная линия успешно ведется, трансгенных мышей сохраняют в гетерозиготной форме и скрещивают с мышами линии C57BL/6. Далее, у животных данной линии была исследована временная динамика экспрессии генетически кодируемого белка ChETA – ускоренного варианта фоточувствительного белка channelrhodopsin-2. Оценка проводилась в нейронах ассоциативной коры головного мозга через разные сроки после эпизода Cre-рекомбинации, вызванной когнитивным воздействием на фоне введения тамоксифена. Данное исследование было необходимо, чтобы определить сроки накопления и максимальной экспрессии ChETA в нейронах генетически модифицированной когнитивной сети с целью выбора оптимального временного окна для проведения последующих экспериментов по оптогенетической стимуляции. Для оценки временной динамики экспрессии ChETA в нейронах мозга мышей битрансгенной линии Fos-Cre- ChETA проводили визуализацию одной и той же области прелимбической коры каждый день в течение 7 дней после эпизода Cre-рекомбинации, вызванной обучением мышей в задаче условно-рефлекторного замирания на фоне инъекции тамоксифена. Через два часа после обучения не было выявлено ChETA-положительных нейронов, через день после обучения было выявлено порядка 17% ChETA-положительных нейронов от максимального количества, которое было выявлено на третий день после обучения и сохранялось при дальнейших эпизодах визуализации. Таким образом, максимальная экспрессия и накопление ChETA в нейронах, вовлекавшихся в когнитивный эпизод, происходит на третий день после Cre-рекомбинации, и сохраняется в дальнейшем, что позволяет проводить эксперименты по оптогенетической стимуляции на мышах Fos-Cre-ChETA начиная с третьего дня после эпизода Cre-рекомбинации. Полученная битрансгенная линия Fos-Cre-ChETA была также подробно охарактеризована по ее поведенческому фенотипу. Это требовалось, чтобы выяснить отсутствие изменений поведения, обучения и возможности формировать память у гетерозиготных животных с knock-in мутацией в локусе эндогенного гена c-fos, известного своей важной ролью в обеспечении механизмов обучения и нейрональной пластичности. Поведенческое фенотипирование животных было проведено в стандартных тестах на исследовательское поведение (тест «открытое поле»), тревожность (тест «приподнятый крестообразный лабиринт»), моторную координацию («ротарод»), а также в модели условно-рефлекторного замирания, которая используется как основная модель формирования ассоциативной памяти в данном проекте. Было установлено, что трансгенные животные полученной линии демонстрируют не отличающееся от контрольных животных локомоторное и исследовательское поведение в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт», имеют нормальную моторную координацию и двигательное научение в тесте «ротарод», и успешно формирую долговременную память об условном сигнале в модели обучения условно-рефлекторного замирания. Мыши данной битрансгенной линии имели такженезначительно более высокие показатели общей длительности актов замирания (р = 0.047) в приподнятом крестообразном лабиринте. Этот фактор необходимо учитывать при планировании дальнейших поведенческих экспериментов с мышами этой линии, однако, исходя из остальных показателей поведения в данном тесте, вывод о повышении общего уровня тревожности у этих трансгенных животных, сделать нельзя. В целом, мыши битрансгенной линии Fos-Cre-ChETA могут быть успешно использованы для различных поведенческих экспериментов, требующих оптогенетической стимуляции генетически захваченных когнитивных нейронных сетей. Для оценки эффективности оптогенетической стимуляции у животных битрансгенной линии Fos-Cre-ChETA была проведена оценка активации нейронов области в стимуляции. Оценку проводили с помощью иммуногистохимического выявления маркера нейрональной активации с-Fos на срезах мозга мышей через 90 минут после их оптогенетической стимуляции через оптроды, вживленные в область прелимбической коры. Было показано, что оптогенетическая стимуляция популяции нейронов прелимбической коры, которые были активны по экспрессии белка с-Fos при обучении в задаче условно-рефлекторного замирания на звуковой сигнал, приводит к значимому увеличению экспрессии с-Fos по сравнению с контрольной группой, у которой стимулируемые нейроны были генетически захвачены в домашней клетке. Эти результаты подтвердили эффективность оптогенетического эффекта у данной битрансгенной линии животных. В исследованиях 2018 года новые технологии захвата и модификации когнитивных нейронных сетей применялись также для изучения механизмов формирования и извлечения ассоциативной памяти. Прежде всего, были исследованы эффекты избирательной оптогенетической стимуляции нейронов ассоциативной коры, активировавшихся при выработке условного рефлекса. Результаты этих экспериментов показали, что на поведенческом уровне естественное извлечение памяти с помощью звукового сигнала приводит к реакции замирания у обученных битрансгенных мышей, в то время как оптогенетическая стимуляция нейронов прелимбической коры, захваченных у этих животных при формировании памяти, не вызывает такого эффекта. В то же время, было обнаружено, что оптогенетическая стимуляция нейронов прелимбической коры, которые были активны при формировании памяти о звуковом условном сигнале и генетически модифицированы белком ChETA, вызывала д обширную активацию других нейронных популяций в мозге этих животных. Так, активация сходного количества нейронов по экспрессии c-Fos при естественном извлечении памяти звуковым сигналом и оптогенетической стимуляцией генетически захваченных нейронов прелимбической коры была получена для областей СА1, СА3 и зубчатой фасции гиппокампа, а также в латеральном и базолатеральном ядрах миндалины. При этом анализ экспрессии с-Fos в центральном ядре миндалины выявил даже увеличение плотности Fos-положительных клеток у животных, которым проводили искусственной извлечение памяти по сравнению с естественным. Таким образом, несмотря на отсутствие поведенческого эффекта от стимуляции генетически захваченных нейронов энграммы в прелимбической коре, она активировала ряд структур мозга мыши на том же уровне, что и естественное извлечение памяти внешним условным сигналом. Данные о том, что не все элементы когнитивной нейронной сети при их оптогенетической стимуляции способны служить заменой внешнего стимула были ранее получены в работе Ramirez et al. (Science, 2013; 341:387-91). Ими была найдена такая диссоциация при сравнении стимуляции нейронов энграммы в области зубчатой фасции и СА1 области гиппокампа. Однако в этой работе авторы не осуществили проводившуюся нами проверку эффектов оптогенетической стимуляции на активность нейронов различных структур головного мозга. Тот факт, что согласно нашим данным при стимуляции кортикальных нейронов следа памяти наблюдается диссоциация между возникновением системной реакции в мозге и отсутствием реакции на поведенческом уровне, представляет фундаментальный интерес и требует дальнейшего исследования. Согласно одному из предположений, по сравнению с клетками зубчатой фасции нейроны энграммы в коре головного мозга обладают меньшей воспроизводимостью участия в извлечении памяти и поэтому их стимуляцией сложнее вызвать интегрированный поведенческий ответ. Проверку соотношения участия кортикальных нейронов в приобретении и извлечении опыта мы осуществляли в специальной серии экспериментов с двухфотонной визуализацией активации нейронов париетальной ассоциативной коры при приобретении и извлечении памяти о звуковом условном сигнале в модели обучения трансгенных мышей линии fos-eGFP условно-рефлекторному замиранию. В этих опытах было установлено, что большая часть нейронов париетальной ассоциативной коры, активировавшихся при обучении, впоследствии активируется и при извлечении памяти. Альтернативное объяснение результатов наших оптогенетических экспериментов состоит в том, что только определенные регионы формирующейся при обучении когнитивной нейронной сети способны при их активации вызывать полноценный интегрированный поведенческий акт. Данное предположение ведет к необходимости оптогенетического картирования мозга животного для выявления таких критических областей. Эта задача стоит перед будущими проектами.