Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В ходе работ по проекту были созданы генетические конструкции (8 шт.) на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса и лентивируса, кодирующие гены GDNF и HGF, как человека, так и мыши: pAAV-hHGF, pAAV-mHGF, pAAV-hGDNF, pAAV-mGDNF, LeGO-hHGF, LeGO-mHGF, LeGO-hGDNF, LeGO-mGDNF. Бакуловирус с геном hGDNF был предоставлен Тайваньским партнером. Ранее нами получены соответствующие конструкции с маркерным геном GFP. В процессе отработки методики генетической модификации МСК ЖТ человека и мыши векторами с геном GFP стало ясно, что не удается получить воспроизводимо достаточно высокую трансдукцию МСК ЖТ мыши (выше 50% клеток) в то время как это удалось для МСК ЖТ человека. Поэтому, учитывая лимит времени, было принято решение работать далее с МСК человека и использовать для решения задач 2017 – 2018 гг. иммунодефицитных мышей. Отработан протокол генетической модификации ААВ МСК ЖТ человека. Эффективность трансдукции МСК ЖТ человека аденоассоциированным и лентивирусом с геном GFP, определенная как доля экспрессирующих GFP клеток, составила 55-65% и 85-95% соответственно. Гибель клеток во время трансдукции не превышала 5%. При этом использование аденоассоциированного вируса 2-ого или гибридного серотипа не давало значимых различий в эффективности модификации клеток. Получены генетически модифицированные МСК ЖТ человека, которые в большом количестве секретируют белки HGF и GDNF. При этом было обнаружено, что немодифицированные МСК ЖТ человека исходно не секретируют ни один из этих ростовых факторов. Уровень секреции HGF модифицированными МСК ЖТ человека достигал пика на 5 день после трансдукции аденоассоциированным или лентивирусом, концентрация белка в кондиционированной среде (48-часовая инкубация клеток) достигала ~ 150 и ~ 680 нг/мл соответственно. Концентрация GDNF в кондиционированной среде (48-часовая инкубация клеток) достигала ~ 9 и ~ 55 нг/мл при модификации МСК ЖТ аденоассоциированным или лентивирусом соответственно. Согласно плану работ нами был проведен сравнительный анализ эффективность продукции GDNF всеми тремя типами вирусов как секретируемого белка с терапевтическим эффектом для выбора вирусной системы для дальнейшей работы. Бакуловирусная система, хотя и продемонстрировала очень высокий уровень экспрессии белка, тем не менее, обладала транзиторным эффектом с пиком продукции и дальнейшим снижением до стабильного уровня, почти в 5 раз ниже, чем на 3-4-ые сутки после модификации. При этом, с помощью системы Cre/LoxP, хотя и удалось добиться расширения периода экспрессии до 3-х недель, удержать количество нарабатываемого GDNF при использовании данной системы, не удалось. Поскольку стимуляция регенерации нерва требует длительного повышения продукции нейротрофических факторов и по соображениям дальнейшей трансляции полученных результатов в клинику был выбран наиболее безопасный вектор на основе аденоассоциированного вируса. Учитывая высокий уровень и длительную продукции целевого белка при использовании лентивирусных (ЛВ) конструкций, мы все же провели сравнение влияния модификации ААВ и ЛВ с генами HGF и GDNF на функции МСК ЖТ человека. При исследовании влияния генетической модификации на экспрессионный профиль клеток было обнаружено помимо значительного возрастания мРНК HGF и GDNF как при ААВ, так и при ЛВ трансдукции, увеличение мРНК с-met, uPAR и FGF2 в МСК ЖТ, модифицированных ЛВ с генами HGF и GDNF. Генетическая модификация МСК ЖТ как ААВ, так и ЛВ независимо от трансгенов умеренно снижала пролиферацию клеток. При исследовании дифференцировочных свойств модифицированных МСК ЖТ было установлено, что модификация ЛВ независимо от трансгена повышает способность МСК ЖТ к индуцированной остеогенной дифференцировке и снижает способность к адипоцитарной дифференцировке, не влияя на эндотелиальную и нейральную дифференцировку. Модификация клеток ААВ с генами HGF и GDNF не оказывала влияния на их способность к этим дифференцировкам. Суммарные продукты секреции (кондиционированная среда) МСК ЖТ модифицированных ААВ или ЛВ с геном HGF , оказывали стимулирующий эффект на ангиогенез in vitro (модель формирования HUVEC тубулярных структур на Матригеле), а продукты секреции МСК ЖТ, модифицированных ААВ или ЛВ с геном GDNF, не оказывали более выраженного стимулирующего эффекта на ангиогенез, чем продукты секреции немодифицированных клеток. Для оценки влияния на ангиогенез самих модифицированных клеток использовали модель формирования карилляроподобных структур эндотелиальными клетками, иммобилизованными на декстрановых бусах, в фибриновом геле. МСК добавляли в фибриновый гель и оценивали количество сосудоподобных отростков и их длину. Оказалось, что МСК ААВ HGF оказывают выраженный стимулирующий эффект на отрастание сосудоподобных струтур от декстрановых бус, увеличивая в 2,5 раза длину формирующихся отростков уже на 3 день со-культивирования и количество отростков по сравнению с эффектом немодифицированных клеток. МСК ААВ GDNF оказывали менее выраженный стимулирующий эффект. Довольно неожиданные результаты были получены с МСК ЛВ HGF и МСК ЛВ GDNF. Несмотря на значительно большую продукцию HGF и GDNF и стимулирующий эффект на ангиогенез продуктов секреции МСК ЛВ HGF в модели тубулогенеза на Матригеле, добавление МСК, трансдуцированных лентивирусом, не только не стимулировало формирование сосудоподобных структур в фибриновом геле, но напротив, даже подавляло этот процесс. Возможно, это обусловлено отчасти слишком большой продукцией HGF, что вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток и препятствует формированию отростков. С другой стороны, это может быть эффект самой лентивирусной трансдукции. Механизм требует дальнейшего изучения. Таким образом, суммируя полученные результаты данной части работы, можно заключить, что модификация МСК ЖТ человека аденоассоциированным вирусным вектором, несущим гены HGF и GDNF, не оказывает влияния на дифференцировочные свойства МСК ЖТ, повышает их способность стимулировать ангиогенез. Модификация лентивирусным вектором независимо от трансгена изменяет дифференцировочные свойства, усиливая остеогенную дифференцировку и уменьшая адипогенную дифференцировку МСК ЖТ. Помимо этого модификация лентивирусным вектором снижает ангиостимулирующие свойства МСК ЖТ, по крайней мере, в модели со-культивирования МСК ЖТ и эндотелиальных клеток. Учитывая это для дальнейшей работы мы остановили свой выбор на модификации МСК ЖТ аденоассоциированными вирусными векторами, несущими гены HGF и GDNF

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе работ по проекту проведено исследование влияния продуктов секреции генетически модифицированных МСК ЖТ, продуцирующих GDNF и HGF, на рост аксонов в моделях in vitro. Работа проведена на двух моделях для изучения роста аксонов (нейритов): модель отрастания нейритов от спинальных ганглиев неонатальной мыши в эксплантной культуре (DRG explants) и модели отрастания нейритов от культивируемых нейронов, дифференцированных из линии клеток мышиной нейробластомы - Neuro2А (N2a) (ATCC® CCL-131™). Для стимуляции отрастания нейритов от эксплантов спинальных ганглиев к ним добавляли кондиционированные среды (КС), собранные с МСК ЖТ мыши, трансдуцированных аденоассоциированным вирусным вектором, несущим гены mHGF и mGDNF (AAV HGF и AAV GDNF), а также смесь этих сред в соотношении 1:1. В качестве контроля использовали КС, собранную с немодифицированных МСК ЖТ или модифицированных тем же вектором, но несущих ген GFP. Визуализацию экспланта и рост нейритов наблюдали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания против специфического белка аксонов neurofilament 200, анализ клеток, мигрирующих из экспланта проводили по их подсчету по ядрам, визуализированным DAPI с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200M, оснащенного цифровой камерой AxioCam HR (Carl Zeiss, Германия). Полученные изображения эксплантов были проанализированы для оценки количества мигрирующих клеток, количества и длины формирующихся нейритов. При исследовании влияния КС генетически модифицированных МСК ЖТ, продуцирующих HGF и GDNF, на отрастание нейритов от спинальных ганглиев неонатальной мыши было обнаружено кооперативное воздействия суммарных продуктов секреции МСК, модифицированных GDNF и HGF, на миграцию клеток из ганглия и скорость роста нейритов, что позволяет предполагать кооперативное влияние GDNF и HGF на эти процессы. Для подтверждения влияние самих факторов - GDNF и HGF и их комбинации на эти процессы мы провели эксперименты с рекомбинантными белками. Установлено, что воздействие рекомбинантного GDNF, HGF и их комбинации приводило к увеличению количества отрастающих нейритов и их длины, которое было наибольшим при воздействии комбинации рекомбинантных GDNF и HGF. Оба фактора увеличивали длину отрастающих нейритов почти вдвое по сравнению с контролем, а их комбинация – почти втрое. Эксперименты с рекомбинантными белками подтвердили кооперативный эффект комбинации GDNF и HGF прежде всего на скорость роста нейритов, что выражалось в их большей длине за определенное время (24 часа). Для подтверждения влияния продуктов секреции генетически модифицированных МСК, продуцирующих GDNF и HGF, на нейритогенез мы использовали модель отрастания нейритов от культивируемых нейронов, дифференцированных из линии клеток мышиной нейробластомы - Neuro2А (N2a) (ATCC® CCL-131™). Изучено влияние продуктов секреции модифицированных клеток на дифференцировку клеток Neuro2А и отрастание нейритов, которая индуцируется депривацией с 0,1% сывороткой и тормозится при культивировании Neuro2А с 10% сывороткой. Установлено, что КС от немодифицированных МСК не индуцировала дифференцировку клеток нейробластомы, в тоже время КС от МСК-HGF, МСК-GDNF и МСК-HGF/GDNF стимулировала дифференцировку и рост нейритов при наибольшем эффекте МСК-GDNF и МСК-HGF/GDNF. Для подтверждения влияния HGF и GDNF на нейритогенез в данной модели мы исследовали влияние рекомбинантных факторов на рост нейритов и их длину в уже дифференцированной депривацией с 0,1% сывороткой культуре клеток нейробластомы. Было установлено, что и рекомбинантный HGF и GDNF стимулируют рост нейритов. Полученные результаты свидетельстуют о том, что продукты секреции МСК, модифицированных генами HGF и GDNF, стимулируют рост нейритов в моделях in vitro, причем совместное использование сред МСК-HGF и МСК-GDNF или двух рекомбинантных факторов обладает кооперативным действием. Для изучения возможного механизма кооперативного эффекта HGF и GDNF на нейритогенез мы дополнительно провели исследование влияния рекомбинантного HGF и совместного влияния HGF и GDNF на внутриклеточный сигналинг в линии клеток Neuro2А. Установлено, что оба фактора могут активировать C-met (рецептор HGF) в клетках нейробластомы, но только GDNF может стабильно активировать Erk1/2 сигналинг. Комбинация HGF и GDNF продемонстрировала кооперативное действие на активацию C-met и сигнального пути Erk1/2. Таким образом, мы получили доказательства кооперативности HGF и GDNF в их действии на C-met и внутриклеточный сигналинг в нейральных клетках, что может, хотя бы отчасти, объяснять кооперативность влияния этих факторов на процесс роста нейритов от спинальных ганглиев. Проведена оценка влияния генетически модифицированных МСК ЖТ, продуцирующих GDNF и HGF, на рост сосудов и нервных окончаний in vivo на модели васкуляризации подкожного имплантата Матригеля. Модифицированные и немодифицированные МСК сингенных мышей вводили в Матригеле в область паха и через 14 дней оценивали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания срезов Матригеля его васкуляризацию и прорастание в него нервных окончаний. Было показано, что трансплантация МСК-HGF оказывала значительтный стимулирующий эффект на васкуляризацию имплантат Матригеля, чего не наблюдалось при трансплантация МСК-GDNF. В то же время, трансплантация МСК-GDNF и МСК-GDNF/HGF стимулировала прорастание в имплантат Матригеля нервных окончаний. Суммируя результаты, полученные при выполнении этой задачи работы, можно заключить, что МСК ЖТ мыши, модифицированные AAV, несущим ген HGF, обладают способностью эффективно стимулировать ангиогенез in vivo, причем добавление к ним МСК ЖТ, модифицированных AAV, несущим ген GDNF, не приводит к увеличению ангиогенного эффекта. МСК ЖТ мыши, модифицированные AAV, несущими гены HGF, GDNF или смесь модифицированных клеток - МСК-HGF/GDNF способствуют стимуляции роста нервных окончаний in vivo, причем МСК-HGF/GDNF обладают, вероятно, наибольшей эффективностью. Однако, эффекты обнаружены только на уровне тенденций. Мы планируем проверить этот эффект in vivo на клинически более релевантной модели повреждения периферического нерва на следующем этапе работы. Проведена отработка метода получения тканеинженерных конструкций в виде пластов клеток (cell sheets) из генетически модифицированных МСК ЖТ, продуцирующих GDNF и HGF, и исследованы характеристики МСК (пролиферации, апоптоза, дифференцировки, формирование межклеточных контактов, синтеза белков матрикса) в составе этих конструкций. Для адаптации ранее отработанной совместно с Тайваньской стороной модели создания клеточных пластов из немодифицированных МСК крысы для генетически модифицированных МСК мыши мы подбирали условия для их культивирования на 12 луночных планшетах в соответствии с рекомендациями Тайваньских коллег, имеющих многолетний опыт получения подобных конструкций из модифицированных клеток. Подбиралось количество клеток, состав среды, метод открепления. В результате оптимальным оказалось культивировать клеточные пласты в течение 72 часов 1100 тыс. клеток на лунку в ДМЕМ+P/S+FBS с аскорбиновой кислотой 50мкг/мл с использованием для открепления либо термочувствительного пластика либо версена. Это позволяло получить прочный пласт клеток, который при снятии не рвался и мог быть перенесен для трансплантации без нарушения его целостности. При исследовании продукции белков интереса было установлено, что при формировании пласта из двух типов клеток – МСК-HGF и МСК-GDNF продукция обоих белков не изменяется по сравнению с их продукцией в монослое клеток или клеточным пластом, образованным клетками одного типа. Проведено изучение состояния генетически модифицированных МСК ЖТ в составе клеточных пластов с помощью методов иммунофлуоресцентного окрашивания со специфическими антителами. Установлено, что часть клеток (до 5%) в составе пласта пролиферирует (позитивность по Ki67), очень небольшая часть (до 1%) находится в апоптозе (позитивность по каспазе 3), клетки образуют контакты через коннексин 43, клетки не дифференцируются в нейральном направлении (нет тубулин III + клеток), но часть их дифференцируется в эндотелиальном направлении (5-7% ETS-1+ клетки), клетки активно синтезируют внеклеточный матрикс (коллаген 1 и фибронектин) . Существенных различий по этим параметрам между немодифицированными и модифицированными МСК ЖТ, продуцирующими HGF или GDNF не обнаружено. В результате выполнения этой задачи отработан метод получения клеточных пластов (cell sheets) из модифицированных МСК ЖТ, продуцирующих GDNF и HGF, которые будут использованы в дальнейшем для решения задач 2018 года. Было установлено, что генетическая модификация не оказала существенного влияния на пролиферацию, апоптоз, дифференцировку в эндотелиальном и нейральном направлении и синтез внеклеточного матрикса клетками в составе пласта. Полученные нами при выполнении первых двух задач 2017 года данные о способности ангиогенного фактора HGF стимулировать рост нейритов in vitro и рост нервных окончаний in vivo позволили нам предположить, что плазмидная генная терапия HGF могла бы быть эффективной для восстановления нарушенной периферической иннервации. Учитывая, что ранее мы показали эффективность плазмидной генной терапии HGF для восстановления кровоснабжения ишемизированной задней конечности мыши (Makarevich, 2012), в рамках данного проекта дополнительно мы провели исследование влияния плазмидной генной терапии HGF на восстановление функции и структуры малоберцового нерва мыши после травматического повреждения (раздавливания). Эффекты внутримышечного введения плазмиды с геном HGF оценивали по следующим параметрам: регистрации суммарного потенциала действия выделенного общего малоберцового нерва, для которого определяли латентный период, амплитуду первого пика и время достижения первого пика; по восстановлению структуры нерва, которое оценивалось по количеству нервных волокон - NF200 + структур на срезах поврежденных нервов после терапии; анализу профиля следа – основного параметра оценки реиннервации после травмы седалищного или малоберцового нерва, напрямую отражающего восстановление функции нерва. Установлено, что внутримышечное введение плазмиды с геном HGF достоверно улучшает проводимость по нерву, восстанавливает его структуру и функцию при сравнении с контрольным введением пустой плазмиды. Таким образом, полученные результаты показали, что генная терапия HGF стимулирует восстановление структуры и функции периферического нерва после повреждения. Учитывая убедительно доказанную эффективность плазмидной генной терапии HGF для восстановления кровоснабжения ишемизированных конечностей не только на экспериментальных моделях, но и в клинике, полученные нами данные могут служить основанием для проведения доклинических и затем клинических исследований эффективности этой терапии при травматических, и что особенно важно, диабетических повреждениях периферических нервов (нейропатии при диабете, сочетающейся с макроангиопатией). Безопасность плазмидной генной терапии, доказанная во многих клинических исследованиях, будет способствовать более быстрой трансляции этих работ в клинику.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На модели ишемии задней конечности у мыши проведено исследование влияния имплантации клеточных пластов из генетически модифицированных МСК ЖТ, продуцирующих GDNF и HGF, на восстановление кровоснабжения конечности, ангио-/артериогенез, размеры некроза и восстановление периферической иннервации ишемизированных мышц. Односторонняя индукция ишемии задней конечности проводилась по ранее отработанному протоколу с помощью лигирования ветвей a. fermoralis с ее дальнейшим иссечением [Makarevich P. et al., PLoS One 2012]. При трансплантации МСК ЖТ в виде клеточного пласта его накладывали на мышцы, окружающие область иссеченного сосуда. Сформировано несколько групп животных: контрольная группа – ишемия конечности без какого-либо воздействия (группа ишемии, n = 9), группа с трансплантацией клеточного пласта из немодифицированных МСК ЖТ или МСК ЖТ, модифицированных AAV с геном GFP (группа МСК ЖТ, n=10), группа МСК ЖТ, модифицированных AAV-HGF (группа МСК ЖТ-HGF, n=10), группа МСК ЖТ, модифицированных AAV с геном GDNF (группа МСК ЖТ- GDNF, n=7) и группа с трансплантацией клеточного пласта, полученного из двух типов клеток МСК ЖТ, модифицированных AAV с геном GDNF и МСК ЖТ, модифицированных AAV-HGF (группа МСК ЖТ – HGF/ GDNF, n=8). Объединение мышей, которым трансплантировали клеточные пласты из немодифицированных МСК ЖТ и МСК ЖТ, модифицированных AAV с геном GFP, в одну группу было обосновано тем, что при раздельном определении динамики восстановления кровотока в этих группах были получены абсолютно одинаковые результаты. Для оценки эффектов трансплантации клеточных пластов проводили измерение динамики восстановления кровотока в ишемизированной конечности с помощью лазер-допплеровского сканера LDI2 (Moor, Великобритания) на 7, 14 и 21 день после операции. Установлено, что трансплантация клеточных пластов эффективно восстанавливает перфузию ишемизированной конечности мыши, причем наибольшей эффективностью обладали клеточные пласты из модифицированных МСК ЖТ, гиперпродуцирующих HGF. В то же время, не обнаружено дополнительного увеличения эффективности восстановления кровотока при использовании клеточных пластов, образованных двумя типами модифицированных МСК ЖТ, продуцирующих GDNF и HGF. Проведено исследование влияния трансплантации клеток на восстановление васкуляризации ишемизированной мышцы для чего с помощью иммунофлуоресцентного анализа оценивали плотность сосудов в передней большеберцовой мышце. Установлено, что механизм стимуляции восстановления кровотока в ишемизированной конечности мыши при трансплантации клеточных пластов из МСК ЖТ обусловлен стимуляцией ангио-артериогенеза, которая также была наиболее выраженной при трансплантации пластов из МСК ЖТ, гиперпродуцирующих HGF. Трансплантация пластов из МСК ЖТ обладала значительным тканепротективным эффектом, который выражался в уменьшении зоны некроза в передних большеберцовых мышцах. Помимо этого, трансплантация клеточных пластов из МСК ЖТ способствовала восстановлению нарушенной иннервации ишемизированных мышц конечности, что выражалось в восстановлении количества нервных волокон, визуализированных на срезах мышц окраской на белок цитоскелета зрелых аксонов NF200. Наиболее выраженный эффект отмечался при трансплантации пластов, образованных МСК ЖТ, гиперпродуцирующих HGF. Для исследования влияния трансплантации клеточных пластов из МСК ЖТ на восстановление проводимости периферического нерва была использована модель травматического повреждения общего малоберцового нерва (N. peroneus communis) в результате сдавливания, что приводит к механическому повреждению и гибели части аксонов и к нарушению кровоснабжения нерва за счет повреждения сосудов перинервия. Восстановление проводимости нерва оценивали по следующим параметрам: латентный период, амплитуда первого пика и время достижения максимального значения для первого пика, peak-to-peak. Повреждение нерва вызывало значительное нарушение его проводимости, что выражалось в уменьшении амплитуды сигнала, удлинении латентного периода и увеличении времени достижения максимального значения для первого пика, peak-to-peak. Трансплантация вокруг поврежденного нерва пластов из модифицированных и немодифицированных МСК ЖТ не приводила к улучшению восстановления проводимости выделенного нерва по сравнению со спонтанным восстановлением. Пытаясь найти объяснение полученному нами отрицательному результату мы перепроверили с помощью ИФА секреторную активность используемых клеточных пластов, так как при их формировании мы всегда собирали и замораживали кондиционированную среду. Оказалось, что все модифицированные клеточные пласты продуцировали соответствующие белки – HGF и GDNF в количествах, близких к тем, которые определялись при отработке методики получения клеточных пластов на этапе 2017 года. Анализа сохранения клеточных пластов после трансплантации показал, что на 14 день клеточных пласт сохраняется и часть его клеток пролиферирует. Учитывая, что трансплантация клеточных пластов на модели ишемии конечности способствовала значительной стимуляции ангио-артериогенеза и восстанавливала нарушенную иннервацию ишемизированной мышцы, для выяснения причин отсутствия эффекта трансплантации клеточных пластов на модели повреждения периферического нерва путем раздавливания необходимы дополнительные исследования. Таким образом, в результате выполнения проекта достигнута его основная цель, а именно разработан метод и изучены механизмы стимуляции регенерации ишемизированных скелетных мышц путем восстановления их кровоснабжения и иннервации с помощью трансплантации клеточных пластов из генетически модифицированных МСК ЖТ, продуцирующих HGF – плейотропный фактор роста с ангиогенными и нейротрофическими свойствами. На предыдущих этапах выполнения проекта было показано, что продукты секреции модифицированных МСК ЖТ , продуцирующих HGF, эффективно стимулируют ангиогенез в моделях in vitro, отрастание аксонов и миграцию швановских клеток на модели спинальных ганглиев неонатальной мыши. На заключительном этапе установлено, что при трансплантации на ишемизированные мышцы задней конечности мыши пласты из МСК ЖТ, гиперпродуцирующих HGF, эффективно стимулируют восстановление кровотока в конечности, ангио-артериогенез, значительно уменьшают некроз и восстанавливают иннервацию ишемизированных мышц. Это указывает на перспективность использования трансплантации клеточных пластов из МСК ЖТ-HGF для лечения тяжелой ишемии нижних конечностей, особенно у больных сахарным диабетом, при котором стенозирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей сочетается с диабетической нейропатией.