Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В результате первого года работы были установлены основные границы работоспособности предложенных принципов построения Биокомпьютерных систем (БКС), предназначенных для целевой доставки лекарственных препаратов в заданные области организма. Проведена первичная оптимизация всех компонентов БКС и оценены параметры и условия ее функционирования. 1. Экспериментально получены БКС конструкции с использованием различных типов частиц-носителей и химической природой поверхности и лиганд-рецепторных взаимодействий, а также исследована эффективность их использования для задач проекта. Полученные результаты по синтезу и подбору оптимальных условий взаимодействия частиц-носителей с клетками опубликованы в высокорейтинговом журнале (Victoria O. Shipunova, Maxim P. Nikitin, Petr I. Nikitin, Sergey M. Deyev. MPQ-Cytometry: a Magnetism-Based Method for Quantification of Nanoparticle-Cell Interactions. Nanoscale, 2016, 8, 12764-12772. IF=7.760 http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/nr/c6nr03507h#!divAbstract ). 2. Проведен выбор оптимального сочетания элементов БКС. Проведено изучение влияния различных факторов на функционирование БКС конструкций в условиях in vitro. С помощью спектрально-корреляционной интерферометрии показано, что выбор молекулярного интерфейса имеет принципиальное значение для процессов сборки и разборки компонентов БКС. Предложены общие подходы для проектирования и практической реализации молекулярных интерфейсов, построенных на балансе коллоидно-химических свойств наночастиц и аффинности молекулярных интерфейсов, используемых для сборки БКС. 3. Разработаны и протестированы биосенсорные системы, реализующие использование «умных», специфически разбирающихся БКС в аналитических системах с колориметрической, спектрометрической и визуальной регистрацией сигнала. В частности, продемонстрировано использование БКС системы в формате иммунохроматографического и других типов анализа для получения логической функции YES для определения нескольких модельных низкомолекулярных мишеней, что свидетельствует об универсальном характере предлагаемого подхода. 4. Получены результаты, демонстрирующие универсальность подхода по созданию БКС конструкций на основе различных частиц-носителей для обнаружения и целенаправленной доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. При помощи сочетания определенных низкомолекулярных маркеров и частиц-носителей, продемонстрирована возможность модулирования процесса узнавания клеток заранее запрограммированным образом. В частности, продемонстрированы БКС, реализующие такие логические функции, как YES и NOT в отношении отдельных маркеров, а также более сложные логические функции при их комбинированном действии. Показано, что разработанный авторами метод MPQ-цитометрии является удобным способом регистрации таких взаимодействий. 5. Получены первые результаты по определению основных закономерностей временной эволюции (времени циркуляции в крови и скорости биодеградации в тканях) таких составляющих БКС, как магнитные наночастицы с разными покрытиями в кровотоке экспериментальных животных (крыс и мышей). С помощью MPQ показано, что скорость биодеградации магнитных частиц лежит в очень широких пределах и находится в прямой зависимости от природы, заряда и размеров используемых микросфер.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В результате второго года выполнения проекта, разработаны компоненты Биокомпьютерных систем (БКС), специфичные к определенным клеткам и несущие лекарственные агенты; разработаны схемы и методы контролирования функционала БКС для реализации логических функций с молекулярными входными сигналами; а также изучены различные параметры поведения БКС и их компонентов в организме экспериментальных животных: 1. Методами безметочной биосенсорики определены наборы оптимальных элементов БКС-конструкций, обладающих наилучшей скоростью, аффинностью и специфичностью связывания соответствующих аналитов в различных средах. Сформулированы общие рекомендации по проектированию и созданию БКС с требуемыми функциональными характеристиками. Часть результатов были опубликованы в статье: Orlov A. V., Pushkarev A. V., Mochalova E. N., Nikitin P. I., & Nikitin M. P. (2017). Development and label-free investigation of logic-gating biolayers for smart biosensing. Sensors and Actuators B: Chemical. https://doi.org/10.1016/j.snb.2017.11.025 IF=5.401; Q1. 2. Разработаны новые биохимические протоколы и способы изучения взаимодействия биомолекул, основанные на использовании трехмерных структур, с магнитометрическим и индуктивным считыванием биосенсорного сигнала. Достигнуты высокие показатели чувствительности созданных систем при сохранении специфичности и малого времени проведения анализа. Часть результатов была опубликована в статье: Nikitin M. P., Orlov A. V., Znoyko S. L., Bragina V. A., Gorshkov B. G., Ksenevich T. I., Cherkasov V.R. & Nikitin P. I. (2017). Multiplex biosensing with highly sensitive magnetic nanoparticle quantification method. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. https://doi.org/10.1016/j.jmmm.2017.10.078 IF=2.63, Q1. 3. Синтезированы новые частицы с различными коллоидно-химическими характеристиками, а также разработаны ряд оригинальных протоколов получения носителей, способных в составе БКС нести на своей поверхности или в объеме терапевтические молекулы. Разработаны методы функционализации компонентов БКС с применением как классических биохимических методов, так и методов клик-химии. Теоретические аспекты построения БКС отражены в публикации: Sokolov I. L., Cherkasov V. R., Tregubov A. A., Buiucli S. R., & Nikitin M. P. (2017). Smart materials on the way to theranostic nanorobots: Molecular machines and nanomotors, advanced biosensors, and intelligent vehicles for drug delivery. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. IF=4.702, Q1. 4. На примере адресного распознавания клеток различных линий продемонстрирована способность компонентов БКС, несущих в своем объеме или на своей поверхности терапевтические молекулы, взаимодействовать с эукариотическими клетками и изучены соответствующие критические параметры. 5. Установлены закономерности зависимости времени циркуляции и биораспределения от свойств частиц (компонентов БКС) в здоровых мышах и мышиных опухолевых моделях при помощи магнитной резонансной томографии и оригинальных магнитометрических устройств. Разработаны общие подходы по комплексной оценке биосовместимости и биобезопасности БКС. Отдельные части работы опубликованы в статье: Tregubov A. A., Sokolov I. L., Babenyshev A. V., Nikitin P. I., Cherkasov V. R., & Nikitin M. P. (2018). Magnetic hybrid magnetite/metal organic framework nanoparticles: facile preparation, post-synthetic biofunctionalization and tracking in vivo with magnetic methods. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 449, 590-596. https://doi.org/10.1016/j.jmmm.2017.10.070 IF=2.63, Q1. 6. По результатам проделанных в рамках проекта исследований опубликовано 4 статьи (все журналы из Q1 квартиля по данным http://www.scimagojr.com/, рекомендованным РНФ) с суммарным импакт фактором 15,363 и сделано 7 докладов на Международных и Всероссийских конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Будут получены результаты по оценке эффективности работы БКС (чувствительность, специфичность, время реакции и т.д.) на клонах модельных клеточных линий in vitro. Выполнено. Были получены результаты по оценке чувствительности и специфичности работы БКС при реализации основных логических функций в отношении к исследованным гаптенам. Было показано, что максимальную чувствительность имели БКС на основе полимерных магнитных наночастиц и наночастиц ферригидрита в качестве базовых и экранирующих частиц, соответственно. В частности, предел обнаружения (т.е. минимальная концентрация активирующего гаптена, при которой БКС переключалась в активное состояние и связывалась с клетками с генерацией сигнала, надёжно отличающегося от фона) для такой конструкции при реализации логической функции YES(ФК) составил ок. 5 мг/л фолиевой кислоты при времени отклика системы не более 5 минут. При этом формируемый сигнал (т.е. связывание с клеткой-мишенью) был специфичен и статистически значимо (p<0,01) отличался от негативного контроля. 2. Будут установлены протоколы методов количественного контроля эффективности и специфичности связывания БКС с различными типами клеток. Выполнено. Разработано: а) два протокола (двух-стадийный гомогенный формат и одностадийный формат непосредственного взаимодействия клеток с БКС) количественного контроля эффективности и специфичности связывания БКС с прикрепленными и полусуспензионными культурами клеток, основанных на применении оригинального метода магнитной цитометрии; б) на основе применения комбинации методов проточной визуализирующей и магнитной цитометрии также разработан протокол количественного контроля связывания БКС с суспензионными культурами. 3. Будут созданы БКС-агенты специфического таргетинга клеток крови лабораторных животных (мышей), регулируемые присутствием в окружающей среде биологических молекул. Выполнено. На примере четырех типов БКС, построенных на основе полимерных карбоксилированных магнитных частиц (ПМЧ), тозилатных магнитных частиц (ТМЧ), коацерватных белковых частиц (КБЧ) на основе бычьего сывороточного альбумина и магнитных сополимерных наночастиц на основе полимолочной и полиглюконовой кислот (MPLGA), созданы наноструктуры, реализующие функцию специфического связывания с CD4-положительными клетками в образце цельной крови мышей под управлением логических функций типа YES и NOT. Данные функции подразумевают связывание агента с таргетными клетками только в присутствии (YES) или отсутствии (NOT) управляющих гаптенов, в качестве которых были исследованы хлорамфеникол и фолиевая кислота. Показано, что БКС на основе ПМЧ и ТМЧ работали более специфично и с большим динамическим диапазоном. 4. Будут получены данные, аналогичные п.3, по таргетингу различных раковых клеток. Выполнено. На основе оптимизированных ранее протоколов созданы четыре типа БКС, реализующие функцию специфического связывания с HER2/neu-положительными прикрепленными клетками рака молочной железы (BT-474 и SKBR-3) под управлением логических функций типа YES и NOT и сложной двух-компонентной функции (YES and NOT). Выполнение данных функцией контролировалось комбинацией управляющий гаптенов (хлорамфеникол и фолиевая кислота). Выполнение простых логических функции YES и NOT было успешно продемонстрировано для всех типов исследованных БКС, а сложной функции (YES AND NOT) – для двух (ПМЧ и ТМЧ) их четырех типов БКС. 5. Будут получены результаты по оценке терапевтического влияния на опухоли разработанных компонент БКС, нагруженных доксорубицином или другими противоопухолевыми препаратами. Выполнено. В рамках проекта исследованы цитотоксические свойства отдельных компонентов четырех типов перспективных БКС – в том числе семи потенциальных терапевтических агентов (доксорубицина, даунорубицина, паклитакселя, иматиниба, фторурацила, цисплатина и куркумина) как в свободном виде, так и в виде терапевтической нагрузки БКС. Показано, что в то время как ненагруженные БКС и его компоненты не обладают токсическим действием на исследованные клетки (BT-474 и CHO), их нагруженные цитостатическими препаратами версии в ряде случае оказываются весьма эффективными для уничтожения раковых клеток, особенно в случае использования даунорубицина и доксорубицина. Максимальную цитостатическую активность продемонстрировали частицы-носители на основе PLGA, нагруженные даунорубицином, и на основе КБЧ, нагруженных паклитакселем. 6. Будут получены данные по характеризации фармакокинетических свойств БКС-конструкций и их компонентов in vivo (времени циркуляции в кровотоке, профили биораспределения по органам и тканям и т.п.). Выполнено. В продолжение исследований, начатых в предыдущем году, нами завершено изучение основных фармакокинетических параметров поведения БКС в кровотоке животных (мыши), проведенные на расширенной выборке животных и с использованием новых перспективных типов БКС. Анализ расширенного массива данных позволил сделать ряд новых наблюдений и подтвердить сделанные ранее предварительные выводы, касающиеся свойств БКС и их изменения в условиях физиологического окружения. В частности, отмечены особенности in vivo поведения БКС, включающих в себя стабилизированные карбоксиметил декстраном компоненты. Такие компоненты хотя и хорошо работают c точки зрения биокомпьютинга, могут ускорять вывод наноконструкций из кровотока. Отмечается, что решение этой и ряда других выявленных проблем для создания терапевтических БКС in vivo, требует дальнейшей полномасштабной проработки в рамках отдельного проекта. 7. Будут разработаны протоколы комплексных методов мониторинга наноагентов in vivo, максимально адаптированных к особенностям сложного поведения БКС. Выполнено. На основании анализа накопленной информации о времени циркуляции собранных БКС и их центральных частиц был разработан комплексной подход, заключающийся в одновременном изучении кинетики циркуляции БКС на базе магнитных центральных и немагнитных экранирующих частиц, в сочетании с одним или несколькими методами детекции клеточного таргентинга (например, проточная цитометрия, магнитометрический анализ органов и тканей, гистологические и микроскопические измерения и т.д.). Согласно разработанной концепции, при значительном различии времени циркуляции БКС до и после их специфической разборки, любые данные по клеточному таргетингу считаются некорректными и требуют пересмотра конструкции БКС в сторону выравнивания времени циркуляции его составных частей. 8. Будет проведен выбор наиболее перспективных БКС, пригодных для функционирования in vivo. Выполнено. После многостадийного скрининга и испытаний в in vivo и in vitro условиях, нами выбраны три наиболее перспективные БКС, каждая из которых имеет свои преимущества и предпочтительную область применения. Так, БКС на основе ПМЧ, хорошо зарекомендовали себя для создания «умных» систем для биовизуализации и диагностики in vitro. В тоже время, низкая терапевтическая емкость и быстрое выведение из кровотока in vivo ограничивает их применение для терапевтических целей. С другой стороны, БКС на основе КБЧ и MPLGA частиц-носителей обладают отличной терапевтической активностью и низкой собственной токсичностью, что делает их привлекательными для дальнейшего исследования в качестве «умных» тераностических агентов после решения проблем, соответственно, введения магнитной мелки и улучшения технологии биофункционализации. 9. Будут полностью выполнены взятые обязательства по суммарной публикационной активности за три года выполнения Проекта. Выполнено. Взятые обязательства по публикации не менее 9 печатных работ в российских и зарубежных научных изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Core Collection) или «Скопус» (SCOPUS) полностью выполнены – опубликовано 12 печатных работ, из них 8 – в научных печатных изданиях первого квартиля (Q1) с суммарным импакт-фактором 87.640. Кроме того, еще одна публикация в журнале Q1 находится на финальной стадии публикации: она прошла этап рецензирования и в ближайшее время ожидается ее принятие в печать. Особо хотелось бы отметить публикацию обзора в таком авторитетнейшем научном издании как Chemical Reviews (4 место в мире по величине импакт-фактора среди научных изданий). Данный обзор является фактически первой в мировой практике попыткой обобщить достижения в стремительно развивающейся области биокомпьютинга и нанобиоробототехники. Учитывая открытый доступ к данной публикации и репутацию издания, которое выбрало тему данного обзора для обложки своего октябрьского номера, можно ожидать укрепления авторитета и лидирующих позиции российской науки в этом крайне перспективном направлении.