Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Болезни сердечно-сосудистой системы по-прежнему остаются ведущей причиной смертности в мире, и гипертоническая болезнь играет центральную роль в развитии таких грозных осложнений как инфаркт миокарда и мозговой инсульт. Несмотря на большие достижения медицины в создании эффективных антигипертензивных препаратов, осуществить необходимый контроль за уровнем АД удается лишь у каждого третьего больного гипертонической болезнью. Создается впечатление, что эффективность фармакологического лечения гипертонической болезни достигла своего потолка, и дальнейший прогресс зависит от развития принципиально новых подходов к ее терапии. Одним из таких направлений является применение технологий генной терапии, включающей использование специально сконструированных фрагментов нуклеиновых кислот (НК), оказывающих целевое воздействие на узловые звенья патогенеза болезни. Фрагменты РНК и ДНК способны узнавать определённые последовательности в генах или мРНК и селективно ингибировать их функции с максимальной эффективностью и минимальными побочными эффектами. Это является существенным преимуществом таких соединений по сравнению с обычными фармацевтическими препаратами, обладающими меньшей специфичностью. Работа по данному проекту посвящена изучению возможностей терапии гипертензивных состояний путем введения в организм экспериментальных животных нанокомпозитов TiO2•PL-ODN, состоящих из конъюгатов полилизина с антисенс-олигонуклеотидами (PL-ODN), иммобилизованных на наночастицах диоксида титана. TiO2-наночастицы обеспечивают доставку олигонуклеотида в клетки, а олигонуклеотиды могут блокировать функции ключевых для развития гипертонии генов. В качестве мишеней были выбраны мРНК генов, кодирующих синтез рецепторовангиотензина-II-АТ1A и ангиотензин превращающего фермента – АПФ1, вовлеченных в патогенез гипертонической болезни. Были получены олигонуклеотиды ODN-I и ODN-III, направленные на выбранные мишени, их конъюгаты с полилизином PL-ODN-IиPL-ODN-III и нанокомпозиты TiO2•PL-ODN-I и TiO2•PL-ODN-III на основе наночастиц диоксида титана. В качестве контрольных образцов были использованы нанокомпозиты TiO2•PL-ODN-I-k и TiO2•PL-ODN-III-k, несущие олигонуклеотиды со случайными последовательностями, некомплементарными соответствующим мРНК. Разработан метод получения ранее не описанных нанокомпозитов TiO2•PL-ODN-S, содержащих олигонуклеотиды с тиофосфатными межнуклеотидными связями. Исследование воздействия предложенных нанокомпозитов на уровень артериального давления экспериментальных животных проводилось на популяции гипертензивных крыс линии НИСАГ (ISIAH), гипертензия которых является результатом наследственной предрасположенности к развитию гипертензивных реакций в условиях эмоционального стресса. Было исследовано функционирование основных звеньев ренин-ангиотензин-альдостероновой системы у гипертензивных крыс НИСАГ в сравнении с нормотензивными крысами Вистар. Ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РАС) является базовым регулятором, обеспечивающим поддержание водных объемов организма, в том числе и массы крови, наполняющей сосудистую систему, а также тонус сосудистых стенок, что делает эту систему одним из важнейших механизмов регуляции уровня артериального давления. Узловым звеном РАС являются рецепторы ангиотензина-II (АТ1А). Была продемонстрирована повышенная экспрессия рецепторов АТ1А у молодых крыс НИСАГ в продолговатом мозге, что может вызывать стойкое повышение симпатического тонуса у этих животных и приводить, в конечном счете, к росту артериального давления. На периферии стимуляция рецепторов ангиотензина приводит к усилению секреции альдостерона – основного натрий задерживающего гормона. Поэтому ген рецепторов АТ1А стал основной мишенью для антисенс-терапии артериальной гипертензии в модели стресс-зависимой гипертонии у крыс линии НИСАГ. Показано, что активность ренин-ангиотензиновой системы у гипертензивных крыс линии НИСАГ существенно повышена. Это выражается в увеличении концентраций ангиотензина-II и альдостерона в плазме периферической крови и в повышении экспрессии генов, кодирующих рецепторы ангиотензина АТ1А и ангиотензиноген – субстрат для последующего синтеза ангиотензина-II. Ингибиторы образования ангиотензина II - блокаторы ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) - являются в настоящее время наиболее популярными лекарствами для лечения гипертонии. Исследован эффект блокады мРНК генов, кодирующих рецепторы ангиотензина-II первого типа (АТ1A) и ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). В первом случае было использовано внутрибрюшинное введение препаратов, а во втором случае наряду с внутрибрюшинным введением был использован ингаляционный путь. Показано, что однократное введение крысам нанокомпозита TiO2-PL-ODN-I, несущего олигонуклеотид, направленный на мРНК гена АТ1A, приводит к снижению артериального давления (АД) на 30-40 мм рт. ст., которое сохраняется на протяжении 2-х недель. Аналогичное введение крысам нанокомпозита TiO2-PL-ODN-I-k со случайной последовательностью олигонуклеотида не приводит к понижению артериального давления. Таким образом, продемонстрировано, что гипотензивный эффект нанокомпозита TiO2-PL-ODN-I у крыс линии НИСАГ является антисенс-эффектом, который по длительности воздействия значительно превосходит результат с использованием стандартного фармацевтического препарата – лозартана (снижение АД на 33 мм рт. ст. в течение суток). При использовании нанокомпозита TiO2•PL-ODN-III, несущего целевой олигонуклеотид, направленный на мРНК гена АПФ, длительное (на протяжении двух-трех недель) понижение артериального давления на 20–30 мм рт. ст. наблюдалось как при внутрибрюшинном, так и при ингаляционном введении препарата, в то время как при использовании олигонуклеотида со случайной последовательностью эффекта не было. Таким образом, впервые показана перспективность использования предложенных нанокомпозитов TiO2•PL-DNA для терапии гипертонической болезни. Кроме того, впервые продемонстрировано, что для лечения можно использовать ингаляционный путь введения препарата. Результаты, полученные на данном этапе, показывают, что олигонуклеотиды, введенные в организм животного в составе предложенных нанокомпозитов приводят к более длительному эффекту понижения АД по сравнению с традиционными фармакологическими препаратами, принимать которые необходимо не реже, а то и чаще, одного раза в день.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Работа по данному проекту в 2017 г. продолжает начатое в 2016 г. исследование возможности лечения гипертензивных состояний методами генной терапии с применением специально сконструированных фрагментов нуклеиновых кислот, в частности, антисмысловых олигонуклеотидов, оказывающих целевое воздействие на узловые звенья патогенеза болезни. В работе исследовано воздействие нанокомпозитов, содержащих антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (ODN), на артериальное давление гипертензивных крыс линии НИСАГ (ISIAH). На предыдущем этапе были использованы нанокомпозиты TiO2~PL-ODN, несущие конъюгаты олигонуклеотидов с полилизином, иммобилизованные на наночастицах диоксида титана. На данном этапе, наряду с нанокомпозитами на основе наночастиц диоксида титана, исследованы нанокомпозиты Si~ODN на основе кремний-органических наночастиц. В качестве мишеней выбраны мРНК генов ренин-ангиотензиновой системы, которая является одним из важнейших регуляторов уровня артериального давления. Получены олигонуклеотиды ODN-I, ODN-II и ODN-III, направленные соответственно на мРНК генов рецепторов ангиотензина-II (АТ1А), бета-1-адренорецепторов и ангиотензин превращающего фермента (ACE1), а также олигонуклеотиды со случайными последовательностями ODN-I-R, ODN-II-R и ODN-III-R, не комплементарными соответствующим мРНК. Синтезированы нанокомпозиты TiO2~PL-ODN-I, TiO2~PL-ODN-III, TiO2~PL-ODN-I-R и TiO2~PL-ODN-III-R. Разработан способ получения кремний-содержащих наночастиц (Si~NH2), на основе которых синтезированы соответствующие нанокомпозиты Si~ODN-I, Si~ODN-II, Si~ODN-III, Si~ODN-I-R, Si~ODN-II-R и Si~ODN-III-R. Исследование воздействия предложенных нанокомпозитов на уровень артериального давления экспериментальных животных проводили на популяции гипертензивных крыс линии НИСАГ (ISIAH), гипертензия которых является результатом наследственной предрасположенности к развитию стойкой артериальной гипертонии в условиях мягкого эмоционального стресса. Исследован эффект блокады упомянутых выше генов с помощью предложенных нанокомпозитов при различных способах введения препаратов. Внутрибрюшинное однократное введение нанокомпозита TiO2~PL-ODN-I, несущего олигонуклеотид, направленный на мРНК гена АТ1A, приводило к снижению артериального давления (АД) на ~30 мм рт. ст., которое сохранялось на протяжении двух недель (данные подтверждают результаты, полученные в 2016 г). При внутрибрюшинном введении нанокомпозита Si~ODN-I наблюдалось достоверное снижение АД на 27 мм рт.ст. Внутривенное введение нанокомпозита Si-ODN-I привело к понижению АД на 30 мм рт. ст. на третий день после инъекции. При внутрисердечном введении Si~ODN-I произошло резкое понижение АД на ~50 мм рт. ст. с последующим его повышением в следующие два дня. Пероральное введение нанокомпозитов Si~ODN-I и TiO2~PL-ODN-I не привело к значимому понижению АД. Внутривенное введение нанокомпозита Si-ODN-II, содержащего олигонуклеотид, направленный на мРНК гена бета-1-адренорецепторов, сопровождалось умеренным понижением АД (на 12 мм рт. ст. в течение четырех-пяти дней). Внутрикардиальное введение нанокомпозита Si-ODN-II практически не давало эффекта. Внутрибрюшинное введение нанокомпозита TiO2~PL-ODN-III, несущего олигонуклеотид, направленный на мРНК гена ACE1, приводило к значительному понижению АД (на 15-20 мм рт. ст.) на протяжении двух недель, в то время как такой же способ введения нанокомпозита Si~ODN-III не оказало воздействия на АД. Пероральное введение нанокомпозитов Si~ODN-III и TiO2~PL-ODN-III не давало желаемого эффекта. Ингаляция нанокомпозита TiO2~PL-ODN-III, содержащего олигонуклеотид, направленный на мРНК гена ACE1, привела к ярко выраженному эффекту: показано наличие достоверного уменьшения АД (~25 мм рт. ст.) в течение недели, и только к третьей неделе уровень АД приблизился к исходному значению. При ингаляции нанокомпозита Si~ODN-III с тем же олигонуклеотидом максимальная разница между первоначальным и минимальным после введения значениями АД составила ~30 мм рт. ст., а среднее значение АД ниже исходного составило 22 мм рт. ст. и держалось на протяжении двух недель. Во всех случаях использование нанокомпозитов, несущих олигонуклеотиды со случайными последовательностями, не приводило к понижению АД. Это свидетельствует о том, что гипотензивный эффект нанокомпозитов на основе как Si-, так и TiO2-наночастиц у крыс линии НИСАГ является антисенс-эффектом, т.е. нанокомпозиты селективно блокируют целевые гены. Исследована экспрессия генов ACE1 и АТ1А на уровне мРНК и белковых продуктов до и после введения соответствующих нанокомпозитов крысам НИСАГ. Экспрессию мРНК генов ACE1 изучали с помощью ПЦР в реальном времени в ткани легких (основное место синтеза фермента). Содержание мРНК гена АТ1А измеряли в ткани почки. Показано, что ингаляция нанокомпозита, включающего антисмысловой олигонуклеотид по отношению к АСЕ1, достоверно снижает экспрессию мРНК гена АСЕ1 в ткани легких и белка АСЕ1 в плазме крови. Внутрибрюшинное введение нанокомпозита с антисмысловым олигонуклеотидом против мРНК рецептора АТ1А также снижала экспрессию соответствующего гена и концентрацию соответствующего белка в почке. В то же время введение нанокомпозитов, включающих олигонуклеотиды со случайными последовательностями, не влияло на экспрессию мРНК генов АСЕ1 и АТ1А. Таким образом, продемонстрировано, что снижение экспрессии генов АСЕ1 и АТ1А под влиянием введения соответствующих антисмысловых олигонуклеотидов является причиной коррекции гипертензивного состояния крыс линии НИСАГ. Показано, что гипотензивный эффект может достигаться как при ингаляционном (для АСЕ1), так и внутрибрюшинном/внутривенном (для АТ1А) введении нанокомпозитов. Таким образом, в работе показана перспективность использования как TiO2~PL-DNA так и Si~ODN нанокомпозитов, включающих антисмысловые ODN по отношению к генам рецепторов ангиотензина-II и ангиотензин-конвертирующего фермента, для терапии гипертонической болезни. Наиболее перспективным следует считать ингаляционный метод введения препаратов, несущих олигонуклеотид, направленный на подавление ACE1. Ингаляция нанокомпозита, включающего ODN-III, направленного на мишень мРНК-ACE1, сопровождается достоверным и продолжительным снижением уровня АД, что является преимуществом по сравнению с действием традиционных фармпрепаратов, которые следует принимать не реже одного раза в день. Использование ингаляции нанокомпозитов, содержащих олигонуклеотид, направленный на блокаду ACE1, мотивируется тем, что основное количество этого белка синтезируется в эндотелии сосудов малого круга кровообращения. Такой метод введения олигонуклеотидов также представляется более предпочтительным для клинического применения.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Работа по данному проекту в 2018 г. продолжает начатое в 2016 г. исследование возможности терапии гипертензивных состояний путем введения в организм экспериментальных животных нанокомпозитов на основе наночастиц диоксида титана или аминосиланола, несущих антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (ODN). Наночастицы обеспечивают доставку олигонуклеотидов в клетки, а олигонуклеотиды могут блокировать функции ключевых для развития гипертонии генов. В качестве мишеней выбраны мРНК генов ренин-ангиотензиновой системы, которая является одним из важнейших регуляторов уровня артериального давления. Исследование воздействия предложенных нанокомпозитов на уровень артериального давления экспериментальных животных проводили на популяции гипертензивных крыс линии НИСАГ (ISIAH), гипертензия которых является результатом наследственной предрасположенности к развитию стойкой артериальной гипертонии в условиях мягкого эмоционального стресса. На данном этапе неагломерирующие наночастицы аминосиланола (Si~NH2) и нанокомпозиты на их основе (Si~ODN) охарактеризованы физико-химическими методами (ИК- и УФ-спектроскопия, ПЭМ, АСМ, динамическое светорассеяние). Показано, что олигонуклеотиды в нанокомпозитах Si~ODN сохраняют способность к комплементарным взаимодействиям. Малый размер частиц и нанокомпозитов обусловливает образование реальных растворов и их сохранность в течение длительного времени (не менее трех месяцев при 4oC) без образования агломератов. С помощью флуоресцентной микроскопии продемонстрировано проникновение флуоресцентно меченных наночастиц и нанокомпозита в эукариотические клетки. Частицы Si~NH2(Flu) основном аккумулируются в цитоплазме, в то время как меченый олигонуклеотид, доставленный в клетки в составе нанокомпозита Si~ODN(Flu), детектируется не только в цитоплазме, но даже в большей степени в ядрах клеток. Показана перспективность использования как TiO2~ODN, так и Si~ODN нанокомпозитов, несущих антисмысловой олигонуклеотид по отношению к мРНК гена ангиотензин-конвертирующего фермента (АСЕ1), для терапии гипертонической болезни. Проведена оценка токсичности препаратов TiO2~ODN и Si~ODN по влиянию на поведение животных и на формулу крови. Показано, что ингаляционное или внутрибрюшинное введение того или другого нанокомпозита не приводило к каким-либо достоверным изменениям в формуле крови и в характере поведения крыс в тесте открытого поля (двигательной активности, уровня страха и исследовательской активности и интенсивности реакции умывания). Это свидетельствует об отсутствии токсичности препаратов в исследуемых условиях. Заслуживающие внимания результаты получены в эксперименте с повторной ингаляцией нанокомпозита Si~ODN. Максимальная разница между первоначальным (200 мм рт. ст.) и минимальным уровнями давления достигла 40 мм рт. ст. уже на второй день после первой ингаляции. На 5-й день, когда давление начало повышаться (все еще будучи ниже первоначального значения на 20 мм рт. ст.), проведена повторная ингаляция, которая снова привела к понижению АД на 40 мм рт. ст. на следующий день; значение АД держалось на уровне в среднем 175 мм рт. ст. в течение пяти дней и только на 10-й день стало приближаться к первоначальному значению. Можно предположить, что периодическая (раз в 5-7 дней) ингаляция нанокомпозита может поддерживать низкий уровень АД. Следует отметить, что традиционные фармацевтические антигипертензивные препараты требуется принимать, по крайней мере, один раз в день. Исследовано распределение флуоресцентно-меченного нанокомпозита SiO2-ODN(Cy7.5) в организме лабораторных животных. Показано, что ретроорбитальное (внутривенное) введение флуоресцентно меченного нанокомпозита приводит к его накоплению в печени и почках животного. Ингаляция нанокомпозита привела к накоплению метки преимущественно в желудочно-кишечном тракте. Однако некоторое количество детектируется в отделе головного мозга животного. В обоих случаях максимальное накопление метки достигается в первые сутки после введения препарата, а через две недели метка полностью выводится из организма. В случае внутривенного введения решающим фактором снижения АД у гипертензивных крыс НИСАГ может служить накопление нанокомпозитов, направленных на блокаду АСЕ1 в почке, т.к. почка является центральным органом ренин-ангиотензиновой системы. Причиной снижения АД при ингаляции нанокомпозитов, скорее всего, является их накопление в структурах мозга, также содержащего автономную ренин-ангиотензиновую систему. Полученные на данном этапе результаты являются крайне важными для выбора подходов к созданию инновационных лекарственных препаратов для снижения артериального давления. В результате выполненной работы предложена оптимальная схема лечения гипертензии у крыс НИСАГ с применением предложенных нанокомпозитов, в основе которой лежит периодическая (раз в 5-7 дней) ингаляция нанокомпозита, несущего олигонуклеотид, направленный на мРНК-АСЕ1.