КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-15-00258

НазваниеE. coli как мишень терапии при болезни Крона

РуководительПобегуц Ольга Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства", г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2016 - 2018

КонкурсКонкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11)

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-227 - Гастроэнтерология и гепатология

Ключевые словаболезнь Крона, Escherichia coli, миелопероксидаза, геном, протеом

Код ГРНТИ76.29.34


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Болезнь Крона (БК) развивается в том числе как осложнение после массированных медицинских вмешательств на фоне длительной лекарственной терапии и проявляется в хроническом воспалении желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Характерно глубокое изъязвление захватывающее как слизистую, так и подлежащие ткани, что приводит к прободению стенки кишечника. Первичный очаг поражения локализуется чаще всего в подвздошной или восходящей кишке, однако впоследствии заболевание приобретает генерализованный характер. Частым осложнением является непроходимость кишечника за счет образования стриктур. Заболевание является пожизненным, полное излечение невозможно, целью терапии является достижение устойчивой ремиссии, что удается далеко не во всех случаях. Болезнь может привести к фатальному исходу за счет различных факторов: перфорации стенки ЖКТ, сепсис, истощение, провокация злокачественных новообразований в ЖКТ. Болезнь наиболее распространена в Северной Америке и странах Северной Европы (до 150 больных на 100 тыс. человек). В Российской Федерации встречаемость в 5-8 раз реже, но имеет четкую тенденцию к росту. В связи с этим, актуальным представляется выяснение механизма развития заболевания и, в частности, выявление роли в патологическом процессе отдельных представителей микрофлоры кишечника. Одним из предложенных механизмов манифестации БК является проникновение бактерий в клетки слизистой кишечника, что провоцирует неадекватный ответ иммунной системы, переходящий в аутоиммунную агрессию. В качестве провоцирующего агента рассматриваются, в том числе, особые штаммы Escherichia coli (БК-ассоциированные, адгезивно-инвазивные E. coli). На настоящий момент сообщается, что четыре изолята E.coli из кишечника больных БК были подвергнуты полному секвенированию генома, однако, пока не удалось выявить какие-либо свойства, специфически характерные для этих штаммов. Более того, попытки сравнительного анализа БК-ассоциированных E.coli ни разу не предпринимались. Таким образом, представляется важным изолировать большее число БК-ассоциированных штаммов E.coli и провести их всестороннюю характеристику – генетическую, протеомную, микробиологическую и биохимическую. Полученные данные позволят сделать ключевые выводы о роли Escherichia coli в провокации и развитии БК. В течении трех лет проекта планируется сбор коллекции штаммов Е. coli от пациентов с БК, а также их всесторонняя характеристика. Методы анализа будут включать в себя полногеномное секвенирование, анализ тотального протеома, анализ сравнительной экспрессии белков (относительно комменсальных штаммов). На основании данных о геноме и протеоме будет проведен биоинформатический анализ, который, как ожидается , поможет выявить характерные для БК-ассоциированных Е. coli геномные и белковые детерминанты. Собранная коллекция штаммов БК-ассоциированных E. coli будет охарактеризована как условно-патогенная группа: будет проведен сравнительный анализ способности к адгезии и инвазии клеток эпителия кишечника человека, способности к образованию биопленок, продукции бактериальных токсинов, продукции бета-лактамаз, подвижности. Предполагается выявить механизм выживания штаммов E.coli в условиях, моделирующих развитие окислительного стресса, обусловленного воспалительными реакциями со стороны организма-хозяина. С этой целью будет проведен анализ взаимодействия полученных изолятов с различными агентами воспалительного процесса: на уровне клетки (нейтрофилы человека), белка (миелопероксидаза нейтрофилов человека), и продуктов их реакций. Полученные в ходе выполнения данные позволят разработать новые схемы диагностики и терапии БК, результаты исследования планируется опубликовать в 8 печатных работах в изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science или Scopus.

Ожидаемые результаты
Результатами настоящего проекта станут: Выявление особенностей, характерных для БК-ассоциированных Е. coli как патогенной/условно-патогенной группы. Прояснение роли E. coli в провокации и патогенезе БК. Запланированные результаты будут уникальны для мирового научного уровня. Подобный системный анализ ни разу не проводился для БК-ассоциированных E.coli. Неизвестен механизм, благодаря которому БК-ассоциированные E.coli выживают в пораженном кишечнике в условиях острого воспаления, а также их роль в поддержании этого воспаления. В результате данного исследования будет выявлено, насколько подавление роста Е. coli в воспаленном кишечнике улучшит состояние больного, а изучение их устойчивости подскажут метод, как достигнуть этого подавления или вообще не допустить возникновения их роста. Полученные данные позволят дать рекомендации по предотвращению развития БК как осложнения в процессе реабилитации после медицинских вмешательств. Облегчение состояния пациентов, уже больных БК путем новых реабилитационных методик позволит сократить их пребывание в лечебных учреждениях, увеличить периоды ремиссий, сократить сроки временной нетрудоспособности и предотвратить тяжкие осложнения. Все это даст как экономический, так и социальный, и гуманитарный эффект - неизлечимость БК в настоящее время приводит не только к физической, но и к социальной инвалидизации пациентов. Таким образом, получение новых знаний о патогенезе БК будет способствовать совершенствованию различных методов реабилитации, направленных на восстановление организма после тяжёлых заболеваний, травм, ятрогенных воздействий.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. Cобрана коллекция из 86 изолятов Е. coli от 20 пациентов с болезнью Крона (БК). Для исследования отбирали пациентов, у кого была диагностирована БК с высокой эндоскопической либо клинической активностью. Возраст пациентов составлял от 9 до 68 лет, 10 пациентов были женщинами, 10 мужчинами. Самая частая локализация поражения – илеоколит. Е. coli высевали из содержимого просвета кишечника, из кала, биопсии слизистой кишечника. Видовую принадлежность бактерий подтверждали методом биотипирования с помощью MALDI-масс-спектрометра Микрофлекс фирмы Брукер и ПЦР-реакций со специфическими праймерами. 2. Проведено полногеномное секвенирование для 25 штаммов E. coli, высеянных из кишечника больных с обострением болезни Крона, методом хемикондукторного секвенирования проводилось на секвенаторе второго поколения Ion Torrent (Applied Biosystems, США). Последовательности геномных ДНК собирали с использованием программного обеспечения Mira и Newbler. Исправление характерных для секвенатора Ion Torrent ошибок в гомополимерах проводили программным инструментом HomoHomo. Этот метод позволяет уменьшить количество ошибок в 2.5 раза. Полученные геномные последовательности были аннотированы с использованием PROKKA 1.7. 3. Биоинформатическими средствами проведен сравнительный анализ генома полученных штаммов как с геномами других БК-ассоциированных штаммов (всего 27), так и с геномами симбионтных штаммов (24). Изоляты из биопсии, кала и просвета пораженного кишечника одного пациента, полученные в нашем исследовании оказывались крайне близки. При этом изоляты от ряда пациентов близки друг другу, а от ряда других – принадлежат к разным филогруппам. Многие изоляты от больных БК содержали потенциально плазмидные контиги, родственные плазмидам патогенных, в том числе уропатогенных штаммов. Примером могут служить две крупные (более 100 тыс пн) плазмиды, не встречающиеся ни у одного из 24 изученных комменсальных штаммов. Одна из них – pLF82, обнаруженная у эталонного адгезивно-инвазивного изолята LF82, выделенного от больного БК. Её гомологи (более 98% сходства на более чем 73% последовательности) встречаются у 4 БК-изолятов, помимо LF82, включая 3 из настоящего исследования. Другая – pljj1886_4, одна из плазмид изолята jj1886 из летального уросепсиса. Её гомологи (более 96% сходства на более чем 88% протяжении) обнаруживаются у 4 БК-изолятов, включая один из настоящего исследования. Сравнение геномов БК-изолятов с комменсальными E. coli позволило выявить ряд генов (гомологов генов), достоверно чаще встречающихся у БК- E. coli. Интересно, что многие из этих генов не изолированы, а входят в состав оперонов. Подавляющая часть этих генов находится в хромосомной части генома и имеет в непосредственной близости признаки геномных перестроек (гены транспозаз, элементы профагов, повторы, перепады в содержании GC-нуклеоидов). Все опероны, обогащенные в БК-группе, обнаруживаются в геноме эталонного БК-штамма LF82. К ним относятся опероны углевод-индуцируемой инвазии (12 генов), утилизации сахарных спиртов (пропандиола 15 генов, и галактитола 7 генов), поглощения железа (2 оперона 12 генов), профаг 1 из LF82 (13 генов) и внешнемембранные (система секреции 2 и сборка клеточной капсулы (9 генов всего)). Все опероны, более представленные у комменсальных бактерий, в геноме LF82 отсутствуют. Это гены метаболизма (деградации ароматических соединений (14 генов), биосинтеза жирных кислот (18 генов) и катаболизма пурина (4 гена)). Также среди комменсально-обогащенных оперонов присутствуют функции, обычно приписываемые потенциальным патогенам, а именно адгезии и инвазии (19 генов), токсин (микроциновый оперон 5 генов), горизонтального переноса генов и защиты от чужеродной ДНК (транспозон Тн7 и CRISPR-система). Таким образом, выявленными БК-ассоциированными признаками можно считать ряд потенциально мобильных элементов генома (плазмид и транспозонов), хотя их роль в патогенезе остается неясной. 4. Для 27 БК-ассоциированных штаммов проведен анализ взаимодействия с различными агентами воспалительного процесса. Выявлен существенных разброс между БК-изолятами E. coli в способности стимулировать активность нейтрофилов и способности нейтрализовать активные формы кислорода. Показана отрицательная корреляция между величиной хемилюминесцентного ответа нейтрофилов цельной крови и внеклеточной пероксидазной и каталазной активностями. Данные морфологического анализа показывают, что даже изоляты, не индуцирующие продукцию активных форм кислорода, вызывают структурные изменения нейтрофилов, однако они значительно меньше подвержены фагоцитозу. Можно предположить, что все бактерии взаимодействуют с мембраной нейтрофилов, но с разным результатом: в одном случае индуцируется сборка NADPH-оксидазы и образование АФК/АФГ, а в другом случае образование АФК и АФГ не запускается; 5. Тест на чувствительность 10 изолятов БК-ассоциированных E.coli к 10 различным антибиотикам проводили по стандартам EUCAST_2014 и CLSI_2009. E.coli, полученные от двух пациентов, были подвержены действию всех антибиотиков. В то же время, изоляты от трех других пациентов обладали множественной устойчивостью. Все изученные изоляты были чувствительны к ампициллину и карбапенемам (имипенему и меропенему). 6. Сравнительный анализ устойчивости к 9 медицинским препаратам бактериофагов и 6 очищенным бактериофагам проведен для 41 и 7 изолятов E.coli от больных БК, соответственно. Тестирование проводили методом спот-теста и перекрестного штрихования. Все культуры были чувствительны к высоковирулентным бактериофагам. Все изученные изоляты оказались резистентны к мужскому фагу М13, что указывает на отсутствие на поверхности этих клеток половых ворсинок F-пилей. В этом случае, клетки БК-изолятов E. coli могут быть охарактеризованы как акцепторы, но не доноры генетического материала, несмотря на наличие в геномах конъюгативных элементов, передающихся через посредство пилей. Из коммерческих препаратов бактериофагов наиболее эффективны были препараты Микроген Инцести, Микроген колипротейный, коли и Микроген пио-б\ф поливалентный. Таким образом, именно эти препараты представляются целесообразными к применению в случае фаготерапии БК.

 

Публикации

1. - «Исследование генома патогенных бактерий» Радиостанция "Говорит Москва", 2016, ноября 26, 12ч05мин. Передача "Ученый свет". (год публикации - ).

2. Манолов АИ, Ракитина ДВ, Каныгина АВ, Гарушянц СК, Байкова ЮП, Алексеев ДГ, Ладыгина ВГ, Кострюкова ЕС, Ларин АК, Семашко ТА, Карпова ИЮ, Бабенко ВВ, Исмагилова РК, Маланин СЮ, Гельфанд МС, Ильина ЕН, Городничев РБ, Лисицина ЕС, Щербаков ПЛ, и др. ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ БАКТЕРИЙ ВИДА ESCHERICHIA COLI, АССОЦИИРОВАННЫХ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА НАУЧНЫЕ ТРУДЫ V Съезда физиологов СНГ V Съезда биохимиков России Конференции ADFLIM, - (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1.5.1. Для 28 клинических изолятов БК-ассоциированных E.coli проанализированы способности к адгезии, инвазии и образованию биопленок в сравнении с контрольной группой (2 лабораторных штамма и 3 изолята от здоровых пациентов). По способности к адгезии клинические изоляты (0 до 10 кл E.coli на клетку CaCo2) не показывали достоверного отличя от контрольной группы (среднее значение 2 кл E.coli на клетку CaCo2). Способность к инвазии клинических изолятов, напротив, в среднем (0.04-0.06%), была несколько выше контрольных значений (0.001%). Образование биопленки также было достоверно выше в образцах E.coli, высеянных из материала биопсий слизистой кишечника, взятых из воспаленной ткани вблизи язвы, и образцах контрольной группы, чем в образцах E.coli, высеянных из материала просвета кишечника. Оценка продукции бактериоцинов проводилась для 15 изолятов от 4 пациентов. Все протестированные изоляты имели бактерицидный эффект (хотя и разной силы) на индикаторные штаммы E. coli. У 12% БК-изолятов E. coli (из 43 протестированных) при культивировании в жидкой среде LB показана продукция бета-лактамазы-CTX-M-1 методом ВЭЖХ-МС. В изолятах от здоровых бета-лактамаз обнаружено не было. По подвижности в полужидком агаре изоляты БК (14 изолятов E. coli от 11 пациентов) сильно превосходили лабораторные штаммы (MG1655 и Nissle 1917), но не показывали достоверных отличий от изолятов от здоровой группы (3 изолята от 3 пациентов). 1.5.2. Сравнительный протеомный профиль для 10 изолятов E. coli от больных БК и 7 изолятов от здоровых добровольцев получали методом дифференцированного окрашивания в условиях 2Д-электрофореза. Воспроизводимая более высокая экспрессия в изолятах от больных БК наблюдалась для 11 белков. Три белка участвуют в цикле трикарбоновых кислот (сукцинат дегидрогеназы и изоцитрат дегидрогеназа). Два участвуют в ответе клетки на внешний стресс – кислотный (глутамат декарбоксилаза) и осмотический (белок Osmy). Три белка расположены во внешней мембране клетки и отвечают за пассивный транспорт (порин А), активный транспорт углеводов (галактоза-метил-галактозид транспортная система) и фолдинг белков во внешней мембране (липопротеин внешней мембраны YfgL). Триптофаназа (вообще имеющая у E. coli более активность более высокую, чем у других бактерий) синтезирует индол, пируват и аммиак. Нуклеозид-дифосфат киназа отвечает за перенос фосфата между нуклеотидди- и трифосфатами. Метилглиоксаль редуктаза нейтрализует токсичное действие метилглиоксаля. Белки, демонстрировавшие более высокую экспрессию у изолятов от здоровых, имели следующие функции (всего 16 белков): антиокислительные (3 белка), гликолиз (2 белка), шапероны (2 белка), транскрипция, трансляция, модияикация белков и пептидов, биосинтез ароматических соединений и клеточной стенки, метаболизм цистеина, устойчивость к кислотному стрессу. Также методом дифференцированного окрашивания в условиях 2Д-электрофореза проведено сравнения профиля белков, экспрессируемых изолятом RCE02-3 от больного БК в различных условиях инкубации. Сравнивали бактерии, предварительно инкубированные в присутствии эукариотических клеток CaCo2 и адгезировавшихся на поверхности этих клеток, с бактериями, инкубированными в среде ДМЕМ без эукариотических клеток. Был выявлен, воспроизводимый эффект инкубации с эукариотическими клетками на протеомный профиль изолята от больного БК. Экспрессия 16 белков была в результате повышена. Эти белки были вовлечены в синтез белка (3 рибосомальных белка, 1 т-РНК-лигаза, 1 лизин-лигаза), ответ на температурный и окислительный стресс (3 белка), устойчивость к антибиотикам (2 белка), биосинтез глюканов и пептидогликанов (2 белка), анаэробное дыхание и деградацию РНК. Функция двух белков неизвестна. Экспрессия 8 белков в E. coli была понижена под воздействием адгезии к эукариотическим клеткам. Интересно, что два из этих белков были именно теми, что отличают изоляты БК- E. coli от изолятов здоровых добровольцев при стандартных условиях выращивания. Это белок триптофаназа (продуцирующая индол) и порин внешней мембраны А. Ещё три белка внешней мембраны (порин C, белок внешней мембраны Х, аскорбат-специфичная фосфотрансфераза) также понижены после адгезии. Такой результат особенно неожиданен, поскольку в литературе, посвященной адгезирующимся штаммам E. coli, порины считаются рецепторами адгезии, а белок Х считается вовлечённым в адгезию, инвазию и устойчивость к системе комплемента. Понижена также экспрессия белков, вовлеченных в биосинтез полиамина путресцина и метаболизм аспартата. 1.5.3. Анализ тотального протеома методом ВЭЖХ с нанопотоком с тандемным масс-спектрометром (nano-LC-MS-MS) был проведен для 43 БК-изолятов (от 29 пациентов) с 20 изолятами от 7 здоровых добровольцев, что позволило выявить достоверные отличия в протеомах этих двух групп. 26 белков чаще идентифицировались в тотальных протеомах БК-изолятов E. coli Их функции перечислены ниже. Устойчивость к антибиотикам - бета-лактамаза-CTX-M1 (мультиустойчивость) и аминогликозид-фосфотрансфераза (устойчивость к канамицину). Поглощение железа – регулятор транскрипции соответствующих генов и рецептор феррихрома внешней мембраны. Эта функция считается характерной для патогенных бактерий, помогающей им выживать в ограниченной по железу среде. Белки внешней мембраны – флагеллин, внешний мембранный порин С (OmpC), шаперон поринов и пилей внешней мембраны (рассматриваются как кандидаты в рецепторы адгезии-инвазии, в частности, во многих публикациях группы Darfeuille-Michaud). Среди белков, обеспечивающих различные метаболические реакции (7 белков), стоит отметить триптофаназу (продуцирует индол, сигнальную молекулу, влияющую на устойчивость бактерий к антибиотикам и фагоцитозу, на образование биопленок, вирулентность и выделение токсинов). Также важной представляется группа белков, вовлечённых в утилизацию пропандиола – белок pduA является продуктом одного из генов оперона, обеспечивающего превращение 1,2-пропандиола в пропаноил-КоА, субстрата для метилцитрат-синтазы и метилцитрат дегидратазы. Последние два белка вовлечены в деградацию жирных кислот и цикл трикарбоновых кислот, связанных с метаболизмом пропаноата через метилцитратный цикл. Оперон pdu, одним из генов которого является pduA, (как показывают результаты, полученные нами в 2016 году), достоверно чаще обнаруживается в геномах БК-изолятов E. coli. Белки, чаще обнаруживаемые в протеоме E. coli, изолированных от здоровых добровольцев (83 белка), по большей части вовлечены в биосинтез аминокислот, антибиотиков, клеточной оболочки, ответ на стресс и метаболизм углеводов. Один из этих белков – лактальдегид редуктаза, осуществляющий реакцию утилизации пропандиола, альтернативную пути pdu-оперона. 1.5.4.Коллекция БК-ассоциированных E. coli пополнена 40 изолятами, высеянными из образцов 10 пациентов, полученных из медицинских учреждений Московской области, Нижнего Новгорода, Сыктывкара, Хабаровска и Казахстана. 1.5.5. Подготовлено к печати и опубликовано 4 статьи в изданиях, цитируемых системами Web of Science и/или Scopus и 7 публикаций, индексируемых в РИНЦ. 1 статья принята к печати в издании, цитируемом системой Scopus.

 

Публикации

1. - Геном кишечной палочки подсказал новый подход к диагностике болезни Крона gazeta.ru, 01.12.2017 (год публикации - ).

2. Байкова Ю.П., Ракитина Д.В., Щербаков П.Л., Говорун В.М. РАЗЛИЧНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ КРОНА Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 5 (141), 33-38 (год публикации - 2017).

3. Букато О., Гаранина Л., Матюшкина Д., Побегуц О., Ракитина Д., Байкова Ю., Ладыгина В., Щербаков П., Говорун В. Proteomic profiling of E. coli, isolated from Crohn's disease patients FEBS JOURNAL, FEBS JOURNAL, Том: 284, Специальный выпуск: SI, Приложение: 1, Стр.: 97-97. (год публикации - 2017).

4. Букато О.Н., Матюшкина Д.С., Ракитина Д.В., Побегуц О.В., Байкова Ю.П., Ладыгина В.Г., Говорун В.М. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПАТОГЕННОСТИ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА ПРОГРАММА И НАУЧНЫЕ ТРУДЫ НАУЧНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ ПО МЕДИЦИНСКОЙ БИОЛОГИИ ФГБУ ФНКЦ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ ФМБА, 2016, с 31 (год публикации - 2016).

5. Вахрушева Т.В., Байкова Ю.П., Балабушевич Н.Г., Гусев С.А., Ломакина Г.Ю., Шолина Е.А., Мошковская М.А., Щербаков П.Л., Побегуц О.В., Михальчик Е.В. Связывание муцина бактериями Escherichia coli из кишечника человека Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2017).

6. Городничев Р.Б., Ракитина Д.В., Щербаков П.Л., Бойкова Ю.П., Ильина Е.Н. АДГЕЗИЯ, ИНВАЗИЯ И БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ E. COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА ПРОГРАММА И НАУЧНЫЕ ТРУДЫ НАУЧНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ ПО МЕДИЦИНСКОЙ БИОЛОГИИ ФГБУ ФНКЦ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ ФМБА, 2016, стр 46-47 (год публикации - 2016).

7. Захаржевская Н.Б., Ванюшкина А.А., Алтухов И.А., Шаварда А.Л., Бутенко И.О., Ракитина Д.В., Никитина А.С., Манолов А.И., Егорова А.Н., Куликов Е.Е., Вишняков И.Е., Фисунов Г.Ю., Говорун В.М. Outer membrane vesicles secreted by pathogenic and nonpathogenic Bacteroides fragilis represent different metabolic activities Scientific Reports, Том: 7, Номер статьи: 5008. (год публикации - 2017).

8. Захаржевская Н.Б., Цветков В.Б., Ванюшкина А.А., Варижук А.М., Ракитина Д.В., Подгорский В.В., Вишняков И.И., Харлампиева Д.Д., Манувера В.А., Лисицын Ф.В., Гущина Е.А., Лазарев В.Н., Говорун В.М. Interaction of Bacteroides fragilis Toxin with Outer Membrane Vesicles Reveals New Mechanism of Its Secretion and Delivery FRONTIERS IN CELLULAR AND INFECTION MICROBIOLOGY, 7, 2 (год публикации - 2017).

9. Манолов А.И., Побегуц О.В., Кострюкова Е.С., Ларин А.К., Семашко Т.А., Бабенко В.В., Городничев Р.Б., Лисицина Е.С., Щербаков П.Л., Ильина Е.Н., Говорун В.М. ПОИСК ГЕНОВ БАКТЕРИЙ ВИДА ESCHERICHIA COLI АССОЦИИРОВАННЫХ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА ACTA NATURAE, СПЕЦВЫПУСК №1 2017 ТОМ 9, 46 (год публикации - 2017).

10. Манолов А.И., Ракитина Д.В., Гельфанд М.С., Ильина Е.Н., Говорун В.М. АССОЦИИРОВАННЫЕ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА ГЕНЫ БАКТЕРИЙ ВИДА ESCHERICHIA COLI ЯВЛЯЮТСЯ ДЛЯ ДАННОГО ВИДА ИСХОДНЫМИ И ПРЕТЕРПЕЛИ МНОЖЕСТВЕННОЕ УДАЛЕНИЕ ИЗ ГЕНОМА БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ, 2017. С. 487-489. (год публикации - 2017).

11. Мошковская М.А., Балабушевич Н.Г., Вахрушева Т.В., Байкова Ю.П., Гусев С.А., Михальчик Е.В. АНАЛИЗ МУКОАДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ, том 1, стр. 147. (год публикации - 2017).

12. Ракитина Д.В., Манолов А.И., Каныгина А.В., Гарущянц С.К., Байкова Ю.П., Семашко Т.А., Бабенко В.В., Гельфанд М.С., Ильина Е.Н., Городничев Р.Б., Щербаков П.Л., Говорун В.М, ... Genome analysis of E. coli isolated from Crohn's disease patients BMC GENOMICS, 18, 544 (год публикации - 2017).

13. Самойлов А.Е., Манолов А.И., Ракитина Д.В., Григорьева Т.В., Ильина Е.Н. МЕТОДИКА ПОИСКА НОСИТЕЛЕЙ ГЕНОВ С РАЗЛИЧНЫМ ФУНКЦИОНАЛОМ В МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ, 2017. С. 404-405. (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Проведено исследование зависимости уровня экспрессии генов Pdu-оперона от источников углерода (спирты (этанол, маннитол, сорбитол), сахара (глюкоза, сахароза, рибоза, лактоза, арабиноза, фукоза, манноза), глицерин, гликопротеин муцин, соли органических кислот (сукцинат, пируват); от присутствия кислорода (аэробные и анаэробные условия), от присутствия сыворотки и при сокультивации изолятов с клеточными линиями аденокарциномы кишечника Caco и SW для БК-изолята В3, который был получен от пациента с диагностированной болезнью Крона в стадии обострения. Наиболее выраженным эффект активации pdu-оперон наблюдался при использовании в качестве источника углерода пропандиола, сукцината и лактозы и при росте на богатой среде LB. Фукоза и муцин не оказывали существенного стимулирующего действия, как и добавление среды, в которой культивировались эукариотические клетки (Табл. 3). Методом дифференциального 2Д электрофореза и ВЭЖХ-МС анализа проведен сравнительный протеомный анализ БК-изолята В3 при культивировании на среде М9 с двумя источниками углерода - 1,2-пропандиола и глюкозы (рис. 4). Показано, что пропандиол стимулипует увеличение уровеня поринов ompC и ompF, компонета фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной транспортной системы сахаров (ptsG), нуклеоид-ассоциированого белка dps, оксидоредуктазных белков NAD(P)H dehydrogenase и CsbD-like protein yjbJ, белка клеточного деления FtsZ, компонента пируват дегидрогеназного комплекса aceF и Acety coenzyme A synthetase (Табл. 5). 2. Проведена проверка адгезивно-инвазивной активности для одного лабораторного штамма Mg1655, трех изолятов E. coli от здоровых пациентов ((IK, Z8, AnL5) и 8 БК-изолятов E. coli (B5, В3, K5, GorK1, PavL1, ZvL2, BruB2, SharL1) (Табл. 6). В отличие от лабораторного штамма и изолятов от здоровых людей, все БК-изоляты могли эффективно адгезироваться и практически все - проникать внутрь клеток. Методом дифференциального 2Д электрофореза и ВЭЖХ-МС проведено протеомное профилирование БК-изолятов К5, BruB2, ZvL2, обладающих наибольшей адгезионно-инвазионной активностью (Рис. 5,6, табл. 7-9). Определены основные направления изменения функционального состояния клеток БК-изолятов при переходе в состояние инвазии: а). Увеличение уровня поринов, что связано, как с активным транспортом низкомолекулярных молекул, так и с процессами адгезии и инвазии. в). Увеличение поринов, которые участвуют в процессах эффлюкса токсичных веществ из клетки, а также в транспорте энтеробактина, необходимого для поддерживания гомеостаза железа в клетке. Поскольку кишечник является средой, обедненной железом, а оно необходимо бактериальной клетке для окислительно-восстановительных реакций, в частности для работы оксидоредуктаз, спасающих клетку от активных форм кислорода, инвазивным E. coli очень важно удерживать ионы железа с помощью энтеробактина. с). Активация системы транспорта сахаров, активация энергетического метаболизма (гликолиза и пентозо-фосфатного пути) и синтеза АТФ. d). Активация системы защиты клетки от окислительного и осмотического стресса. e). Увеличение уровня антитоксинов mqsA и VapB ТА систем II типа mqsA/ mqsR и VapC/VapB свидетельствует об увеличении клеточной подвижности и снижении биофильмообразования. f). Aктивация метаболических путей для использования альтернативных источников углерода, в частности, спиртов.Накопление ферментов, участвующих в утилизации пропандиолав процессе адгезии-инвазии может быть следствием переключения бактерий на "внутриклеточное" потребление. Считается, что компоненты слизи кишечника (муцин и фукоза) могут перерабатываться кишечной микрофлорой с образованием большого количества 1,2 пропандиола. Таким образом, способность утилизировать данный метаболит дает конкурентное преимущество ИЕК по сравнению с другими бактериями, не способными утилизировать пропандиол, а также способствует внедрению бактерии сквозь муциновый слой и колонизации. g). Увеличение представленности карбоангидразы, фермента, участвующего в выделении СО2, которое связано с метаболизмом утилизации пропандиола. h). Активация синтеза нуклеозидов. 3. Показано, что изоляты E. coli из кишечника человека способны связывать муцин, в том числе с помощью маннозо-чувствительных взаимодействия. Существенных различий между изолятами от здоровых людей и пациентов с болезнью Крона не наблюдалось. Адсорбция муцина не влияла на z-потенциал бактерий и их энергетический статус, но усиливало высвобождение АТФ во внеклеточном пространство (рис. 8, табл. 10,11). Установлено, что связавшийся с клетками БК-изолята SharL1 муцин приводит к снижению активации нейтрофилов. Анализ белков плазмы крови после ее инкубации с SharL1 в присутствии муцина и без него показал, что связавшие муцин клетки бактерий теряют способность взаимодействовать с IgG, белками комплемента и некоторыми другими белками плазмы (церулоплазмином и интер-альфа–ингибитором трипсина) (Табл. 13). Предполагается, что ингибирующее действие муцина на активацию нейтрофилов связано с экранированием молекул внешней мембраны бактерий, участвующих во взаимодействии с нейтрофилами. Методами 2Д электрофореза, вестерн-блота и масс-спектрометрического протеомного анализа определены белки внешней мембраны E.coli, способные связывать муцин in vitro: порины Omps (OmpC, OmpD, OmpF, OmpX, OmpW, Omp II*), импортер железа, транспортер витамина В12, фосфоглицераткиназа и фактор элонгации трансляции Ef Tu-1 (рис. 13). Эти белки, помимо прочих своих функций, являются бактериальными поверхностными антигенами, поэтому экранирование их эпитопов в результате связывания с муцином может влиять на динамику иммунного ответа. Сравнительный ВЭЖХ-МС протеомный анализ мембранных фракций, полученных для БК-изолята SharL1, выращенного при добавлении в культуральную среду муцина и без него показал, что муцин стимулирует увеличение уровня белков, которые участвуют в биогенезе и структурной организации внешней мембраны и клеточной стенки (gmhA, pyrH, murC, MreB,), интегральных компонентов мембраны (BamD btuB), белков биосинтеза аминокислот (asnB, argD, glsA), биосинтеза нуклеотидов (pyrH), транскрипционного регулятора RapA, который стимулирует активность РНК-полимеразы в условиях стресса, белка btuB, участвующего в транспорте В12, основного компонента транспортной PTS системы сахаров ptsI и фермента gldA, участвующего в утилизации глицерина. При этом падает уровень белков, участвующих в катаболизме аминокислот (ansB, gcvP), в катаболизме нуклеотидов (udp, deoC) и ферментов пентозофосфатного пути и гликолиза (zwf, pgl, pgk, pykF, pgi) (Табл.15). Изучение влияния муцина на работу pdu-оперона методом РТ-ПЦР (табл. 14) для БК-изолята В3, который был получен от пациента с диагностированной болезнью Крона в стадии обострения и который содержал pdu-оперон, который по набору генов и последовательности был наиболее сходен с таковым из классического Крон-ассоциированного изолята LF82, показал, что экспрессия генов Pdu-оперона снижается в присутствии муцина. 4. Подобраны 4 пары специфических олигонуклеотидов, которые могут быть эффективно использованы для ПЦР-диагностики как болезни Крона, так и в целом воспалительных заболеваний кишечника. Олигонуклеотиды входят в состав генов, специфичных для БК- ассоциированных E. coli - генов Pdu-оперона pduC, ccmk2_1, ccmL и pduU (Табл. 16-18, рис. 14, 15). 5. На основании результатов нашего исследования показано, что для БК-изолятов характерен адгезивно-инвазивный фенотип, причем наиболее значимой особенностью этого фенотипа является отличный от контрольных штаммов протеомный профиль. В данной работе благодаря методам дифференциального 2Д электрофореза и хромато-масс-спектрометрии удалось выявить перечень белковых отличий, который может являться основой для специфической, фенотипической и дифференциальной диагностики группы E. сoli с адгезивно-инвазивным фенотипом у пациентов с болезнью Крона (Табл. 5, 7, 9, 15, Рис. 4, 6). В качестве метода диагностики предлагается использовать метод ИФА с детекцией маркерных белковых отличий между контрольной и исследуемой группой изолированных E. coli. Основные этапы предлагаемой ИФА-диагностики: 1. Сбор биологического материала у пациентов с болезнью Крона (кал, биопсия) 2. Посев на дифференциальную культуральную среду (М9 с двумя источниками углерода - 1,2-пропандиола и глюкозы) 3. Обогащение исследуемой культуры 4. Выделение тотального белка из клеточного массива 5. ИФА тестирование на наличие белковых маркеров адгезивного-инвазивного фенотипа. В качестве маркеров адгезивно-инвазивного фенотипа предлагается использование основных белковых отличий, выявленных нами с помощью различных методов сравнительного протеомного анализа изолятов E. coli (таблица). Проведённый анализ позволил выявить белки, которые меняли свою представленность во всех используемых нами методах, что свидетельствует в пользу высокой специфичности отобранных маркеров.Среди предлагаемых для идентификации посредством ИФА белков следующие: порины (OmpA, OmpX, OmpR), субъединицы АТФ-синтазного комплекса, компоненты фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы, липопротеины-осморегуляторы, компоненты транслоказного комплекса, выполняющего транспорт белков через мембрану, белки клеточного деления (FtsH), ферменты нуклеотидного метаболизма. Таблица. Белковые маркеры – кандидаты для ИФА диагностики БК-ассоциированных E. сoli KZO61758.1 sugar ABC transporter ATP-binding protein KZO62741.1 Cell division protein FtsH KZO64137.1 Preprotein translocase subunit YajC KZO64463.1 arginine ABC transporter ATP-binding protein KZO61269.1 osmolarity response regulator KZO64417.1 Membrane protein OmpX, porin KZO61269.1 Membrane protein OmpA, porin KZ61269.1 Osmolarity response regulator, OmpR Учитывая тот факт, что указанные белковые отличия являются мажорными для данных групп сравнения, можно предположить, что они являются основой патогенетической трансформаций со сменой фенотипа в сторону увеличения адгезивно-инвазивного потенциала, поэтому указанные белковые маркеры могут являться не только предметом тестирования на наличие данной группы бактерий у пациентов, но и выступать в качестве вероятных мишеней таргетной антибактериальной терапии при комплексном лечении болезни Крона. 5. Исходя из данных проведённых в 2016 году тестов устойчивости БК-ассоциированных E. coli к фагам и антибиотикам, а также литературных данных, в работе была проведена оценка возможности сочетания антибиотиков и фагов для терапии БК. Показано, что все изоляты E. сoli, выделенные у больных с болезнью Крона, демонстрировали чувствительность к большинству тестированных антибиотиков (Табл. 19). Однако полученные данные для некоторых изолятов подтверждают факт необходимости индивидуального подбора препаратов. Наиболее эффективными в отношении всех тестированных изолятов оказались антибиотики группы карбопенемов – имипенем и меропенем. Протестирован широкий спектр бактериофагов. Согласно полученным данным, в большом проценте случаев полученные изоляты оказались нечувствительными к воздействию фагов различной природы. Однако в отношении изолятов, для которых была показана резистентность к большинству использованных в тестировании антибиотиков, удалось показать эффективность ряда фагов. Для данных изолятов оказались эффективными фаги “Микроген б\ф колипротейный” и “Микрогенпио-б\ф поливалентный” и “Микроген б\ф коли” и “Микроген Интести б\ф” . Отмечен факт восприимчивости изолятов к фагам с однонитевой ДНК (Таблица 21). Таким образом, суммируя полученные данные важно отметить, что антибактериальная терапия при болезни Крона должна носить таргетный, персонифицированный и комбинированный характер. В частности, как видно из результатов данной работы, успех симптоматического лечения может определяться корректным подбором соответствующей терапии с учетом индивидуальных особенностей восприимчивости флоры, а именно представителей рода Escherichia к различным антибактериальным и фаговым препаратам. Необходимо учитывать и тот факт, что применение антибактериальных препаратов может быть заменено на препараты фагов, в случае обнаружения резистентности флоры, что будет способствовать улучшению состояния пациента, снижению риска развития тяжелой воспалительной реакции на фоне активной стадии болезни Крона.

 

Публикации

1. Байкова Ю.П., Ракитина Д.В., Гаранина И.А., Данилова Н.А., Абдулхаков С.Р., Григорьева Т.В, Маркелова М.И., Одинцова А.Х., Абдулхаков Р.А., Щербаков П.В., Говорун В.М. Propanediol utilization genes as inflammatory bowel disease markers FEBS Open Bio, vol. 8, p.245, P.09-118-Mon (год публикации - 2018).

2. Вахрушева Т.В., Байкова Ю.П., Батабушевич Н.Г., Гусев С.А., Ломакина Г.Ю., Шолина Е.А., Мошковская М.А., Щербаков П.Л., Побегуц О.В., Михальчик Е.В. Reactive oxygen species production by neutrophils activated by Crohn’s disease Escherichia coli in vitro. FEBS Open Bio, vol. 8. p. 250 (год публикации - 2018).

3. Гаранина И.А., Максютов Н.Ф., Орехов Д.И., Логиновский А.О., Букато О.Н., Гладкова М.Г. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МАШИННОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ ПАТОГЕННЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI V МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ “ПОСТГЕНОМ’2018” В ПОИСКАХ МОДЕЛЕЙ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ, - (год публикации - 2018).

4. Михальчик Е.В., Ракитина Д.В., Балабушкевич Н.Г., Хараева З.Ф., Гусев С.А, Гусев А.А, Соколов А.В. Вахрушева Т.В., Побегуц О.В., Байкова Ю.П., Щербаков П.Л., Говорун В.М. Modulatory role of mucin in activation of blood neutrophils by Escherichia coli in vitro FEBS Open Bio, vol.8, p. 232, P.09-078-Wed (год публикации - 2018).

5. Тяхт А.В., Манолов А.И., Каныгина А.В., Ищенко Д.С., Коварский Б.А., Попенко А.С., Павленко А.В., Елизарова А.В., Ракитина Д.В., Байкова Ю.П., Ладыгина В.Г., Кострюкова Е.С., Карпова И.Я., Семашко Т.А., Ларин А.К., Григорьева Т.В., Снягина М.Н. Genetic diversity of Escherichia coli in gut microbiota of patients with Crohn’s disease discovered using metagenomic and genomic analyses BMC Genomics, BMC Genomics 2018. (год публикации - 2018).