Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В настоящее время, проблема «цветения» водоемов приобретает глобальный характер. «Цветения» водоемов обусловлено массовым развитием фототрофных микроорганизмов (ФМ) (цианобактерий и микроводорослей), что создает множество проблем при их рекреационном, хозяйственном и питьевом использовании. Известно, что различные группы ФМ способны синтезировать токсические вещества, цианобактерии, например – цианотоксины. Ежегодно фиксируется около 150.000 случаев отравления людей рыбой или другими продуктами, содержащими токсины ФМ. Существующие на сегодняшний день способы устранения проблемы «цветения» водоемов малоэффективны и дорогостоящи. В настоящем исследовании для эффективного и быстрого удаления ФМ из водной среды мы предлагаем использовать полимерные материалы на основе полиаминов (полиэтиленимина и полилизина), которые могут применяться не только в решении важной экологической проблемы связанной с «цветением» водоемов, но также найти широкое применение в биотехнологии. Известно, что спрос на биомассу микроводорослей (МВ) и цианобактерий (ЦБ) а также продукты на их основе неуклонно растет, однако средняя стоимость биомассы высока и 20-30% от её себестоимости составляют расходы на сбор биомассы, так как применяемые в настоящее время методы являются дорогостоящими, энергозатратными и трудоемкими. Таким образом, разработка более экономичного и эффективного способа сбора биомассы как токсичных, так биотехнологически значимых культур МВ и цианобактерий Цб также является актуальной задачей. Одним из путей создания полимерных материалов на основе полиаминов: полиэтиленимина (ПЭИ) и полилизина (ПЛ), является иммобилизация данных полимерных материалов на инертных пористых природных или синтетических субстратах, например, полистироле. Создавать сорбенты на основе указанных полимеров возможно и путем их сшивания таким агентами как глутаровый альдегид, эпихлоргидрин, диизоцианаты и др., при этом в процессе создания можно получать частицы с высокой удельной площадью поверхности, различной формы, степени пористости и характером поверхности. Варьируя эффективную плотность заряда и химический состав сорбентов, возможно создание полимеров, одновременно обладающих высоким сродством к поверхностным структурам микроорганизмов, в тоже время не влияющих на их жизнеспособность и целостность клеток. В представленной работе была разработана и изучена линейка сорбентов на основе ПЭИ (12 образцов) и ПЛ (1 образец), предназначенных для сбора биомассы Цб и МВ. Были исследованы физико-химические свойства синтезированных сорбентов, их сорбционная способность в отношении культур ФМ, влияние процесса иммобилизации на жизнеспособность иммобилизованных культур. Для получения сорбентов на основе сшитого ПЭИ было применено два подхода. Первый подход включал сшивку ПЭИ при нагревании с эпихлоргидрином, с последующей дегидратацией продукта и таким способом были получены следующий ряд сорбентов серии М33 (M33A, M33B, M33C, M33D), отличавшиеся соотношением эпихлоргидрин-ПЭИ в конечном продукте и способом промывки. Второй способ включал криополимеризацию смеси ПЭИ с диэтиленгликоль диглицидиловым эфиром при температуре -24°С, так были получены сорбенты серии М50 (M50A, M50C) отличавшиеся способом промывки. Также в данной работе в качестве сшивающего агента использовали гексаметилен диизоцианат (M37). Ряд сорбентов (M40A, M41A) был подвергнут алкилированию октил бромидом и гексадецил бромидом с целью повышения гидрофобности поверхности, а также диметилсульфатом для создания полимера, содержащего четвертичные аммонийные группы на поверхности (M53). Для получение сорбента (M60) на основе сшитого ПЛ использовали триэтиленгликоль ди(хлорацетат) в качестве сшивающего агента, который обладает повышенной биосовместимостью благодаря наличию полиэтиленгликоль-подобного фрагмента. Нами была проведена иммобилизация ПЭИ на поверхности сополимера стирола и дивинилбензола (СДВБ), который был предварительно активирован хлорметилированием под действием метил хлорметилового эфира и был получен сорбент Р0516. Еще одним реализованным подходом была иммобилизация ПЭИ на поверхность полимера, содержащего сульфо-группы за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженными -NH3+ группами полиамина и отрицательно заряженными -SO3 группами полимерной матрицы и был получен сорбент АМ02. Таким образом, за отчетный период было синтезировано 12 новых сорбентов на основе ПЭИ и 1 сорбент на основе ПЛ. Исследование физико-химических свойств полученных полимерных материалов показало, что в целом, все сорбенты обладают невысокой насыпной плотностью в сухом состоянии. Сравнение удельной поверхности сорбентов определенной методом газовой порозиметрии показало, что сшитые ПЭИ обладают примерно одинаковой удельной поверхностью вне зависимости от использованного сшивающего реагента, его количества и последующей модификации поверхности, а сорбенты на основе СДВБ характеризуются исключительно высокой удельной поверхностью – 717 м2/г. Среди синтезированных сорбентов наименьшей удельной поверхностью обладает сшитый полилизин (М60). Было проведено исследование поверхности сорбентов методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), которое позволило предположить, как характер поверхности сорбентов может повлиять на эффективность иммобилизации клеток микроорганизмов. Было показано, что все материалы на основе сшитого ПЭИ имеет развитую поверхность и характеризуется наличием пор, бороздок и складок различного размера, предположительно облегчающие прикрепление клеток к поверхности сорбента. Поверхность сорбентов P0516 и AM02 на основе сополимера стирола и дивинилбензола (СДВБ) практически гладкая и не имеет микропор. Анализ динамики и оценка эффективности иммобилизации клеток ФМ (Цб (3 штамма) и МВ (2 штамма) ) на поверхности сорбентов показали принципиальное отличие в сорбирующей способности синтезированных полимерных материалов в зависимости от их химического состава и способа синтеза. Изучение кинетики иммобилизации клеток МВ и Цб на сорбенте из сшитого полилизина (М60) показало, что указанный сорбент характеризуется низкой сорбирующей способностью в отношении клеток изученных штаммов ФМ. Сорбенты на основе сополимера стирола и дивинилбензола с привитым или иммобилизованными на поверхности ПЭИ (P0516, AM02) также оказались малоэффективными, так как не более 20% клеток Цб и МВ заселяли их поверхность в течение суток. Как показали результаты проведенных экспериментов наиболее эффективными для сорбции клеток как Цб, так и МВ оказались сорбент М53А и сорбенты серии M33 и M50 на основе сшитых ПЭИ. Наиболее активно клетки отобранных культур заселяли поверхность сорбента M53A на основе кватернизованного ПЭИ, так в течение 5 мин к поверхности этого сорбента прикрепляется 35-40% клеток. Чрезвычайно высокая скорость связывания сорбента с клетками объясняется наличием в составе M53A четвертичных атомов азота и наибольшей величиной поверхностного заряда характеризующего этот сорбент. Сорбенты M33В и M33C, содержащие эпихлоргидрин в качестве сшивающего ПЭИ агента ненамного уступают сорбенту M53A. Сорбенты серии M50, содержащие диэтиленгликоль диглицидиловый эфир в качестве сшивающего компонента, также достаточно активно сорбировали клетки исследованных культур, однако их сорбционная емкость зависела от рН среды, так при увеличении рН до 10-11, эффективность сорбции в отношении некоторых культур снижалась. Изучение кинетики иммобилизации клеток МВ на гидрофобных сорбентах на основе сшитого ПЭИ показало, что использованный прием гидрофобизации сорбента, путем присоединения алкильного фрагмента не был эффективным для клеток МВ. Другая картина наблюдалась при изучении кинетики иммобилизации ЦБ на сорбентах этого типа. Гидрофобные сорбенты M41A и M40A на основе алкилированнных ПЭИ лишь незначительно уступали гидрофильным сорбентам. Отличие в сорбирующей активности гидрофобных сорбентов в отношении клеток Цб и МВ объясняется присутствием липополисахаридов в составе клеточных стенок грамотрицательных ЦБ, связывающихся с алкильными группами сорбентов. Для оценки жизнеспособности клеток МВ применялся метод импульсно-моделированной флуориметрии, с помощью которого оценивается уровень фотосинтетической активности иммобилизованных клеток. Известно, что наличие токсичных веществ в составе сорбентов может влиять на метаболическую активность клеток в целом и вызывать фотоингибирование. Cорбент M50A на основе ПЭИ, содержащий диглицидиловый эфир диэтиленгликоля в качестве сшивающего агента не оказывал ингибирующего влияния на жизнеспособность клеток. Сорбент M50C, принципиально не отличающийся от сорбента M50A по химическому составу, но отличающийся по способу промывки, был более токсичен для клеток МВ. Наиболее токсичными для клеток 2 исследованных штамм МВ оказались сорбенты M33В и сорбент M33C, содержащие эпихлоргидрин в качестве сшивающего ПЭИ. Таким образом, в результате проделанной работы были разработаны методики химической модификации ПЭИ и были синтезированы нерастворимые, пористые полимерные материалы на основе ПЭИ и ПЛ, предназначенные для эффективной сорбции микроорганизмов из водных сред. Были исследованы физико-химические характеристики полученных сорбентов, включая определение удельной поверхности и изучение морфологии пор. Была исследована эффективность сорбентов различных типов в отношении иммобилизации различных групп модельных микроорганизмов, как прокариот (Цб), так и эукариот (МВ). Было показано, что эффективность иммобилизации зависит от химического состава полученных сорбентов, способа их получения и отмывки на последнем этапе синтеза. Наиболее эффективным следует считать гидрофильные сорбенты на основе квартенизованного полиэтиленимина M53А и сорбенты серии М33, характеризующиеся высокими значениями сорбционной емкости и скорости иммобилизации клеток. Указанные сорбенты могут быть рекомендованы для быстрого извлечения (в течение суток) клеток из водоемов и биореакторов, и не могут быть использоваться для длительного культивирования иммобилизованных культур, так как сорбенты этого типа негативно влияют на жизнеспособность фотосинтезирующих микроорганизмов. Было показано, что клетки исследованных культур с немного меньшей эффективностью заселяют поверхность полимеров серии M50 однако сорбенты этого типа, отмытые с помощью гидрокарбоната натрия не оказывают негативного влияния на жизнеспособность и метаболическую активность прикрепленных клеток и поэтому могут применяться в биореакторах при длительном культивировании фототрофных микроорганизмов.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В результате проделанной работы получено 5 серий сорбентов на основе сшитого полилизина, полиэтиленэмина (ПЭИ) и композиции ПЭИ с полилизином (всего 24 сорбента). Показано, что сшитый полилизин не обладает требуемыми свойствами, а введение полилизина в матрицу ПЭИ оказалось нецелесообразным, ввиду ухудшения сорбционных свойств материала по сравнению с соответствующим сшитым ПЭИ. Следует отметить, что добавление полилизина, ввиду его большей стоимости в сравнении с ПЭИ, можно считать не рентабельным. Синтез сорбентов на основе сшитого ПЭИ проводился по двум методикам: термополимеризацией, в этом случае пористость создавалась благодаря пузырькам кипящей воды, и криополимеризации, в условиях замораживания-оттаивания, при этом формирование полимера происходило вокруг микрокристаллов льда. В качестве сшивающих агентов были выбраны эпихлоргидин (ЭХГ) и диэтиленгликоль диглицидиловый эфир (ДЭГ). Было синтезировано 20 сорбентов с различным соотношением ПЭИ и сшивающих агентов. Основная идея выбора двух разных сшивок, заключалась в том, чтобы проверить, как длина линкера влияет на свойства материала: так ЭХГ обеспечивает сшивку достаточно коротким фрагментом, длиной в три атома углерода, а ДЭГ – значительно более длинным – в тринадцать атомов. При этом оба линкера являются подвижными алифатическими фрагментами, что обеспечивает подвижность цепей полимера в конечном материале и способствует его набуханию, делая доступной для связывания клеток максимально возможную поверхность. Все материалы были исследованы методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), была показана их разветвленная пористая структура с порами диаметром от 1 до 50 мкм. Анализ зависимости характера поверхности сорбентов от их химического состава и способа получения, показал, что с уменьшением количества сшивающего агента, количество пор на поверхности снижается. Все сорбенты характеризовались невысокой насыпной плотностью, варьирующей от 0,15 до 0,38 г/мл. Химическое строение полимеров подтверждено методом ИК-спектроскопии и элементным анализом. Теоретически рассчитанные соотношения концентраций углерода и азота, в большинстве случаев, сходились с данными, полученными при элементном анализе сорбентов. Несмотря на то, что значения удельной поверхности сорбентов, полученные методом газовой порозиметрии в приближении BET были не высоки (от16 до 69 м2/г), однако ввиду значительного набухания в водных растворах (увеличение массы до 23 раз при pH 9) сорбенты обладают высокой доступной поверхностью. Показана высокая стабильность сорбентов при температурах до 100 °С и умеренная – до 200 °С. Для оценки возможности вымывания различных веществ были приготовлены водные и спиртовые вытяжки сорбентов. Путем измерения УФ-поглощения, изменения pH, восстановительных примесей (перманганатной окисляемости), определения аминов в водной фракции и органических соединений в спиртовой фракции было показано, что большинство сорбентов безопасны. По результатам исследований кинетики взаимодействия сорбентов с клетками фототрофных микроорганизмов – микроводорослей (МВ) и цианобактерий (Цб), можно заключить, что сорбирующая активность сорбентов зависит от способа сшивки, природы и концентрации сшивающего агента. Установлено, что уменьшение количества сшивающего агента в составе всех изученных серий сорбентов, приводит к увеличению количества прикрепленных клеток. Увеличение сорбционной активности сорбентов при уменьшении степени сшивки, по-видимому, связано с увеличением количества положительно-заряженных аминогрупп, участвующих в электростатическом взаимодействии с отрицательно-заряженной поверхностью МВ и Цб. Следует отметить, что, несмотря на более высокую сорбирующую активность, слабо сшитые полимеры сильно набухают в водных средах, и поэтому работа с ними усложняется. Оптимальными для сбора биомассы МВ и Цб были признаны сорбенты, в которых концентрация сшивающего агента составляла не менее 7,5%. В целом, сорбенты, полученные при полимеризации с ЭХГ, обладали большей эффективностью, в сравнении с ПЭИ, сшитыми с помощью ДЭГ. С целью выявления потенциально токсичных для окружающей среды полимеров, была проведена оценка влияния синтезированных сорбентов на клетки как эукариотных, так и прокариотных организмов. Оценка токсичности, проведенная на позвоночных животных (крысах) показала, что пероральное введение сорбентов не приводило к патологическим изменениям в организме тестируемых животных. Наличие ингибирующего эффекта на жизнедеятельность клеток МВ и фотобактерий была связано с низкой концентрацией сшивающего агента. Самыми безопасными были признаны сорбенты, полученные путем сшивания ПЭИ с помощью ДЭГ концентрацией 60-120%. Указанные сорбенты не влияют на жизнеспособность фототрофных микроорганизмов и фотобактерий, их можно использовать при долговременном культивировании клеток в фотобиореакторах. Все остальные исследованные сорбенты могут быть рекомендованы для быстрой и эффективной сорбции клеток Цб и МВ из водных сред. Следует отметить также, что сорбирующая активность большинства из исследованных полимерных материалов значительно превосходит существующие на сегодняшний день аналоги.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Для снижения стоимости сорбентов на основе полиэтиленимина (ПЭИ) и увеличения их биодеградации было предложено введение в состав синтетических полимеров, полученных на предыдущих этапах исследования, различных биоматериалов. За основу был выбран сорбент К-ДЭГ60, показавший высокую сорбционную эффективность в отношении модельных культур микроводорослей (МВ) и цианобактерий (Цб). На 2 этапе исследований также было доказано полное отсутствие токсичности К-ДЭГ60 для клеток фототрофных микроорганизмов, люминесцентных бактерий и позвоночных животных. В качестве биоматериалов было предложено использовать биомассу и клеточно-структурированный материал (КСМ) суспензионных культур клеток растений Ajuga turkestanica, Polyscias fruticosa, талломов водорослей Laminaria saccharina, а также яблочный жмых, которые могут рассматриваться в качестве дешевых, биодеградируемых и нетоксичных наполнителей для полимерных композитных материалов. Культивируемые клетки растений, водоросли являются объектами уже внедренных и разрабатываемых биотехнологий и после получения из них целевого продукта оставшаяся биомасса и КСМ могут быть использованы при создании сорбентов. В результате было синтезировано 15 образцов сорбентов, содержащих различные биоматериалы. Для серии сорбентов с целью повышения адгезии клеток оксигенных фототрофных микроорганизмов (ОФМ) к поверхности полимерным композитов, возобновляемое растительное сырье предварительно обрабатывали бифункциональным реакционноспособным агентом – гексаметилендиизоцианатом. Исследования физико-химических свойств полученных материалов показали, что введение биомассы растительных компонентов в полимерный материал приводило к увеличению набухания. Обработка диизоцианатом наполнителя перед введением в полимерную матрицу приводила к получению материалов, обладающих заметно сниженным набуханием, за исключением материалов на основе яблочного жмыха. Также наблюдалось увеличение набухания сорбентов, содержащих КСМ. Вероятно, подобная закономерность обусловлена наличием пустот внутри клеток, недоступных для ПЭИ, но при этом доступных для молекул воды. Изучение поверхности полимеров методом сканирующей электронной микроскопии показало, что введение растительного материала в виде биомассы в состав сорбентов на основе ПЭИ существенно изменял его структуру. Образцы всех полученных сорбентов с растительным материалом по сравнению с К-ДЭГ60 имели более развитую поверхность пор и каналов как на поверхности, так во внутренней части. Было показано, что все синтезированные материалы не проявляли какого-либо токсического действия на клетки модельных культур МВ в течение долговременного инкубирования. Фотосинтетическая активность сохранялась для иммобилизованных клеток в течение продолжительного времени, что подтверждается данными флуоресцентного анализа. Мы не наблюдали морфологических изменений и нарушения целостности клеток МВ, прикрепленных к поверхности всех изученных сорбентов. На примере сорбента, содержащего биомассу A. turkestanika, было показано отсутствие токсического эффекта на биолюминисцентные бактерии P. phosphoreum. Известно, что существующие на сегодняшний день способы сбора биомассы Цб усложняются из-за трудности прогнозирования и подбора оптимальных способов иммобилизации, связанных с морфологическим и физиологическим разнообразием культур Цб. Для комплексной оценки эффективности синтезированных полимеров, предназначенных для сорбции фототрофных микроорганизмов как в природных средах, так и при промышленном культивировании было проведено детальное исследование сорбционной способности носителей, отобранных на 2-ом этапе. В качестве объектов для изучения динамики адгезии были отобраны следующие Цб: трихомы гетероцистосодержащих Цб Nostoc muscorum PCC 6310, Anabaena variabilis ATCC 7120, Anabaena variabilis ATCC 29413 (IV субсекция); трихомы нитчатых, не образущих гетероцисты Цб Arthrospira (Spirulina) maxima, Leptolyngbya sp. 2Dp86E (III субсекция); одноклеточная Цб Synechococcus sp. 1Dp66E-1 (I субсекция). Выбранные модельные штаммы Цб различаются организацией поверхностных структур - слизистых чехлов и капсул. Способность к иммобилизации на сорбентах у Цб с разной морфологической организацией трихомов и поверхностных структур клеток на сорбенте К-ДЭГ60 можно расположить в последовательности: N. muscorum PCC 6310 > A. variabilis ATCC 29413 > A. variabilis ATCC 7120 > Leptolyngbya sp. 2Dp66E F1 > A. maxima > Synechococcus sp 1Dp66E-1. Более эффективная иммобилизация трихомов гетероцистообразующей Цб Nostoc muscorum PCC 6310 на сорбентах, по видимому связана с формированием, по сравнению с другими штаммами трихомных Цб, более мощных, сложно организованных многослойных чехлов. Таким образом при выборе материалов Результаты сравнительной оценки эффективности иммобилизации сорбентов, содержащих биомассу и КСМ различных наполнителей показали, что полученные полимеры обладали высокой сорбционной емкостью в отношении клеток модельных культур фототрофных микроорганизмов. В течение 48 ч на полученных сорбентах иммобилизовалось от 55 до 90% клеток МВ. Наиболее эффективными были сорбенты, содержащие биомассу и КСМ A. turkestanika и P. fruticosa, наименее активными сорбенты на основе L. saccharina и яблочного жмыха. В случае бионаполнителя L. saccharina наиболее эффективным было введение в состав композитного материала КСМ, а не биомассы данной культуры. Также следует добавить, что введение изоцианатов в состав полимеров с указанным наполнителем также способствовало увеличению эффективности иммобилизации. В случае P. fruticosa композитные материалы с добавлением биомассы были более эффективны по сравнению с КСМ этого растительного наполнителя, хотя отличия в эффективности иммобилизации были незначительными. Эффективность иммобилизации сорбентов, содержащих биомассу и КСМ A. turkestanika практически не отличалась, введение в состав полимера ПЭИ-At50 изоцианатов, также не приводило к увеличению эффективности иммобилизации на протяжении всего эксперимента. Сорбент на основе биомассы яблочного жмыха обладал наименьшей сорбционной активностью в отношении модельных культур Lobosphaera CALU925 и Desmodesmus sp., однако введение изоцианатов в состав указанного биокомпозитов способствовало увеличению эффективности иммобилизации МВ в среднем на 15-18%. Результаты по исследованию биодеградации сорбентов показали, что микроорганизмы деструкторы полученных сорбентов широко распространены в почвах разных биотопов и деградация их при применении in vivo не приведет к накоплению сорбентов в окружающей среде. На основании полученных исследований была проведена разработка рекомендаций по использованию сорбентов в реальном секторе экономики. Сорбенты, полученные в данной работе, могут быть рекомендованы для сбора биомассы Цб и МВ в водоемах в качестве одной из стадий ремедиации для борьбы с «цветением». Также они могут с успехом применяться для рекультивации и сбора биомассы фототрофных микроорганизмов в биотехнологических производствах. Сорбционные материалы рекомендуется запаковывать в проницаемые кассеты из полимерного материала, устойчивого к воздействию окружающей среды, однако в случае сбора биомассы из биореакторов допускается использовать сорбент в виде порошка или губки, набухающей в воде. В этом случае следует применять только механически прочные полимеры, особенно наполненные биовозобновляемым растительным сырьем.