Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В проекте 1 мы исследовали эффект дисульфид-связной димеризации на термодинамическую стабильность белка. Для целей настоящего исследования нами был выбран второй РНК-распознающий домен нейропатологического белка TDP-43. Используя точечный мутагенез и данные ДСН-ПААГ и масс-спектрометрии, мы установли, что обработка образца H2O2 ведёт к образованию димеров, связанных дисульфидной связью через цистеин C244. В свою очередь, эти димеры образуют крупные нековалентные агрегаты, которые лишь частично удаётся возвратить в мономерную форму с помощью стандартных восстановителей, таких как дитиотреитол. Проведенные ЯМР эксперименты по H/D обмену с использованием HSQC-спектроскопии указывают на то, что дисульфид-связанные димеры RRM2 действительно менее стабильны по сравнению с мономерной формой. Образование относительно короткого дисульфидного мостика приводит к сближению двух белковых поверхностей, которые, вообще говоря, не комплементарны по отношению друг к другу. Случайные комбинации аминокислотных остатков характерные для такого рода некомплементарного интерфейса с большой долей вероятности приводят к дестабилизации внутренней структуры дисульфид-связанных белков. В дополнение к экспериментальным исследованиям в этой области мы также разработали МД протокол, позволяющий генерировать высококачественные (невозмущённые) структурные модели дисульфид-связанных димеров, имея в виду дальнейшие исследования стабильности доменов при помощи МД моделирования. В проекте 2 мы разработали эмпирический МД протокол, позволяющий включить процесс образования дисульфидных связей в МД модели белкового фолдинга. С тем чтобы сделать возможным взаимное сближение двух тиольных групп, мы временно "отключаем" взаимодействие Леннарда-Джонса между атомами серы, принадлежащими боковым цепям цистеинов. В ходе последующего МД моделирования две тиольные группы движутся случайным образом, пока не сближаются на расстояние 2.5 Å, соответствующее радиусу захвата при образовании дисульфидной связи. В этот момент мы накладываем на систему слабые ограничения, имитирующие вновь возникшую дисульфидную связь. Затем эти ограничения постепенно усиливаются, пока не достигают уровня полноценной дисульфидной связи. После этого ограничения заменяются на типовую дисульфидную связь и моделирование продолжается с использованием стандартных параметров силового поля. Новый алгоритм был опробован на пептиде гуанилин, состоящем из 15 аминокислотных остатков, включая 4 цистеина. Записав пятьдесят МД траекторий гуанилина с продолжительностью ок. 1 мкс, нам удалось приблизительно воспроизвести распределение по дисульфид-связанным изомерам в том виде, в каком оно наблюдалось экспериментально. Лучшая из полученных структур физиологического изомера 2 воспроизводит с точностью 2.3 Å (среднеквадратичной отклонение для основной цепи) соответствующую экспериментальную структуру. Вычисления методами GBSA и PBSA, проведенные на МД координатах гуанилина, указывают на то, что окислительный фолдинг гуанилина "в пробирке" происходит под кинетическим, а не термодинамическим контролем. Помимо отделённого гуанилина, мы также исследовали окислительный фолдинг гуанилина в составе прогормона прогуанилина (96 аминокислотных остатков). Начав со случайной конформации сегмента гуанилина, мы наблюдали его свёртывание и образование физиологического изомера 2. Согласно нашим наблюдениям, присутствие "тела" прогуанилина оказывает влияние на формируемую укладку гуанилина, таким образом иллюстрируя функцию прогуанилина как (авто)шаперона. В проекте 3 мы исследуем механизм противоопухолевого действия GO-подобных пептидов, содержащих активный CQC участок. Исходно GO пептиды были задуманы, как миметики сайта димеризации в эпителиальном гликопротеине муцине 1. Однако мы заметили, что GO пептиды, синтезированные из нефизиологических D-аминокислот, сохраняют свою противораковую активность. Со структурной точки зрения подобные "праворучные" пептиды ничем не напоминают муцин. Следовательно источник их антиопухолевых свойств следует искать в другом. Действительно, проведя серию экспериментов на клеточных культурах, мы обнаружили, что линия фибросаркомы HT-1080, которая вовсе не экспрессирует муцин, в наибольшей степени чувствительна к обработке GO пептидами, в то время как линия карциномы молочной железы ZR-75-1, для которой характерна гиперэкспрессия муцина 1, демонстрирует лишь умеренную чувствительность. Более того, мы обнаружили, что новый GO-подобный пептид, содержащий CGC мотив и обладающий свойствами дисульфид-изомеразы, демонстрирует уровень онкосупрессорной активности сопоставимый с исходными GO пептидами. Всё это подтверждает нашу гипотезу о том, что механизм наблюдаемого антиопухолевого действия отличается от того, что предполагалось ранее. При обработке клеточных культур GO пептидами мы обратили внимание на то, что существующий протокол маскирует возможный эффект накопления дозы. Таким образом, получаемые результаты могут быть неверно истолкованы и их перенос в клиническую практику может оказаться затруднительным. Для изучения этого аспекта проблемы мы протестировали ряд альтернативных протоколов. Эти эксперименты заставили нас пересмотреть минимальные требования к дозировке GO пептидов. Наконец, мы обнаружили, что обработка GO пептидами влияет на уровень активных форм кислорода в раковых клетках. Полученные результаты дают основания для интересного предположения – не исключено, что GO пептиды наиболее эффективны по отношению к тем клеточным линиям, которые характеризуются исходно высоким уровнем окислительного стресса. В проекте 4 мы используем данные по температурно-зависимой релаксации спина 15N в качестве целевого ориентира для сравнительного анализа различных моделей воды в контексте МД моделирования неупорядоченных белков. Для целей этого проекта мы изготовили и экспериментально охарактеризовали образец N-терминального сегмента гистонового белка человека H4. Мы установили, что МД траектории, использующие стандартную модель воды TIP3P и другую хорошо апробированную модель SPC/E, в целом успешно воспроизводят данные температурно-зависимой спиновой релаксации. В то же время недавно появившаяся модель TIP4P-D, созданная специально для моделирования неупорядоченных белков, показывает значительно худшие результаты. По всей вероятности, эта модель недостаточно хорошо согласована с основным массивом параметров силового поля (Amber ff99SB или ff14SB). Анализ успешных МД траекторий показал, что спиновая релаксация 15N определяется двумя динамическими модами: (i) быстрыми локальными движениями, затрагивающими несколько смежных пептидных остатков, и (ii) более медленными глобальными движениями, которые соответствуют конформационным перестроениям всего пептида целиком или его значительной части. Далее мы обнаружили, что при повышении температуры роль локальной динамики повышается, а роль глобальной динамики падает. Такого рода поведение можно описать как "эффект динамической развязки", при котором короткие фрагменты пептидной цепи приобретают достаточную степень динамической свободы и становятся нечувствительны к движениям пептида в целом. В проекте 5 мы исследуем микросекундную конформационную динамику, наблюдаемую в длительных МД траекториях кристаллического убиквитина. Нами записаны две траектории различных кристаллических форм убиквитина, каждая из которых содержит по 24 белковые молекулы вместе с внутрикристаллической водой. Анализ данных МД обнаружил несколько редких конформационных переходов – например, переходы между конформациями, соответствующими β-повороту типа I и типа II на участке G51-R54. Дальнейший анализ позволил идентифицировать ряд внутри- и межмолекулярных взаимодействий, которые стабилизируют подобные неустойчивые конформации. К примеру, раздвоенный солевой мостик между D52 и парой боковых цепей K63, принадлежащих соседним белковым молекулам, оказался ключевым фактором, стабилизирующим β-поворот типа II. Мы предполагаем, что такого рода анализ в сочетании с данными экспериментов твердотельного ЯМР позволит получить детальную картину микросекундных движений в кристаллических белках.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проект 1. РНК-распознающий домен RRM2 нейропатологического белка TDP-43 под воздействием окислительного стресса образует агрегаты, утрачивая при этом свою третичную структуру и переходя в разупорядоченное состояние. Эксперименты по трипсинолизу показали, что в отличие от мономерной формы агрегатные частицы RRM2 подвергаются стремительной протеолитической деградации. Исследование образца RRM2, содержащего мутацию C244S, показали, что перекрёстное сшивание пептидных цепей за счёт дисульфидных мостиков не является необходимым условием формирования агрегатов. Эксперименты по динамическому рассеянию света в сочетании с экспериментами ЯМР, включая измерения коэффициента диффузии с использованием сигналов от "подвижных хвостов" пептидных цепей, позволили оценить размер агрегатных частиц. Более того, на основе этих данных нам удалось охарактеризовать распределение частиц по размерам (для избранных экспериментальных условий характерная ширина распределения составляет от 10 до 30 мономерных единиц). Комбинированный анализ данных динамического рассеяния света и ЯМР в данном контексте представляет из себя новую, ранее не применявшуюся, методологию. Обработка массива данных PDB позволила идентифицировать небольшой белок SUMO2, соответствующий ряду критериев для последующего экспериментального изучения, для которого данные выполненного нами МД моделирования предсказывают распад структуры непосредственно вслед за образованием межмолекулярного дисульфидного мостика. Исследование этого белка предоставляет возможность для детального описания одного из важных механизмов дестабилизации белков под действием активных форм кислорода. Проект 2. Нами разработан эмпирический подход для моделирования процесса образования дисульфидных мостиков в рамках метода МД. С помощью нового алгоритма нам удалось воспроизвести окислительный фолдинг последовательности гуанилина в составе прогормона прогуанилина. Полученная таким образом структура находится в отличном согласии с экспериментальными координатами (1.0 Å для последовательности гуанилина, 2.4 Å для структуры в целом), а также непосредственно с данными ЯМР измерений. В качестве контроля нами была записана серия траекторий для отделённой последовательности гуанилина. Таким образом было показано, что используемая в нашей модели замена стандартного аминокислотного остатка CYS на реакционноспособный радикал CYR не влияет на параметры конформационного распределения в пептидной цепи. Разработанный нами алгоритм будет использован для конструирования и апробации in silico пептидных лигандов, связывающихся с белком-мишенью посредством образования дисульфидного мостика. Проект 3. В этом проекте мы исследуем механизм действия пептидов семейства GО, имея в виду их оптимизацию для применения в качестве противоопухолевых агентов. Нам удалось подтвердить, используя в частности метод иммуноблоттинга, ранее сделанный вывод о том, что цитотоксическая активность GO никак не связана с эпителиальным гликопротеином муцин 1, вопреки распространённой гипотезе. Более того, мы выяснили, что цитотоксический эффект GO-пептидов распространяется не только на раковые, но и на нормальные клетки (напр. дермальные фибробласты и эндометриальные мезенхимальные стволовые клетки). Используя данные проточной цитофлуориметрии и цейтраферной микроскопии, мы показали, что воздействие GO-пептидов приводит к быстрому (в течение ок. получаса) наступлению апоптоза. При этом клеточная гибель не связана с нарушениями клеточного цикла или с проявлениями окислительного стресса, как было установлено с помощью дополнительных цитофлуорометрических данных. Для того чтобы прояснить истинное происхождение цитотоксического эффекта, нами были сконструированы и экспериментально протестированы десять новых пептидов, содержащих активную последовательность CxC или CxxC. При этом некоторые из новых пептидов показали значительно более высокий уровень активности, чем их прототипы из категории GO-пептидов. Полученные результаты заставили нас предположить, что цитотоксическая активность подобных пептидов связана с их действием по механизму дисульфид оксидоредуктазы. Для проверки предложенной нами гипотезы были проведены дополнительные клеточные эксперименты, которые установили, что необходимым условием цитотоксической активности является присутствие двух цистеинов в составе активного участка, что согласуется с предлагаемым действием по механизму дисульфид оксидоредуктазы. Помимо этого, проведенные in vitro эксперименты по ренатурации лизоцима с детекцией методом высокоэффективной жидкостной хроматографии прямо подтвердили, что исследуемые нами пептиды обладают свойствами дисульфид оксидоредуктазы. В качестве следующего шага мы намерены испытать следующее поколение GO-пептидов, содержащих специальные таргетные последовательности для направленной доставки в раковые клетки. Проект 4. Мы применяем сочетание методов экспериментального ЯМР и МД моделирования, включая некоторые последние разработки в этой области, для детального анализа конформационной динамики разупорядоченного белка. Нами было выполнено отнесение спектра ЯМР (1H,13C,15N) N-терминального сегмента гистона H4. В дополнение к данным продольной релаксации 15N R1 в образце N-H4 мы также экспериментально измерили скорости поперечной кросс-корреляционной релаксации η в широком диапазоне температур. Сравнение экспериментальных данных с предсказаниями, полученными методом МД, привели нас к заключению о том, что конформационная динамика N-H4 наиболее достоверно воспроизводится в МД траектории, записанной с использованием модели воды TIP4P-D, которая была разработана специально для применения в контексте структурно разупорядоченных белков. В частности, использование этой модели позволяет избежать образования компактных конформеров N-H4, наблюдаемых в остальных траекториях. Таким образом, сделанные в прошлом году предварительные выводы относительно выбора модели воды подверглись пересмотру. Анализ данных МД показал, что движение пептидной цепи отражает присутствие двух превалирующих динамических мод, которые можно условно обозначить как "локальную" (связанную преимущественно с малыми колебаниями пептидных плоскостей) и "коллективную" (связанную со скачкообразным изменением двугранных углов). Как выяснилось, коллективная динамика распространяется на относительно короткие участки пептидной последовательности (около 5-10 аминокислотных остатков); на более протяженных участках последовательности пространственно-временные корреляции утрачиваются. Проект 5. Мы используем методы МД моделирования в сочетании с данными твердотельного ЯМР и рентгеновской кристаллографии (сотрудничество с Институтом структурной биологии в Гренобле) для исследования динамики белковых кристаллов, включая внутренний конформационный обмен и качательное движение белков в кристаллической решётке. В рамках этого проекта мы занимались моделированием различных кристаллических форм убиквитина, уделяя особое внимание конформационному обмену в β-повороте на участке 51-54. С тем чтобы идентифицировать факторы, влияющие на конформационное равновесие, нами были записаны девять траекторий МД для кристаллов убиквитина, содержащих определённые точечные мутации. Совокупная статистика, получаемая в каждой из этих траекторий, соответствует ок. 50 - 100 мкс белковой динамики. С помощью этих данных нам удалось установить, что относительно редкая конформация β-поворота II типа, обнаруживаемая в кристалле PDB ID 3ONS, обусловлена протонированием боковой цепи Е24 и её ограниченной подвижностью, связанной с особенностями кристаллической упаковки. Нами было отмечено, что время корреляции для конформационного обмена в кристалле убиквитина PDB ID 3N30 практически совпадает со временем корреляции качательного движения. Это заставило нас предположить, что два вышеназванных динамических процесса до определённой степени взаимосвязаны. Анализ траекторий МД позволил нам идентифицировать один вероятный механизм для подобной динамической корреляции – а именно, мы обнаружили что образование межмолекулярного солевого мостика K11-D52 является, с одной стороны, функцией качательного движения убиквитиновых молекул, а с другой стороны, функцией конформационного состояния β-поворота 51-54. Как показали полученные нами данные, мутация К11А ведёт к уменьшению амплитуды качательного движения и, вместе с тем, к снижению пропорции β-поворота типа II в изучаемом кристалле. Этот результат получил определённое экспериментальное подтверждение на основе данных твердотельного ЯМР. Наконец, данные МД моделирования были использованы нами с тем, чтобы продемонстрировать эффект модуляции химического сдвига 15N в масштабе времени микросекунд и тем самым пролить дополнительный свет на происхождение экспериментально наблюдаемых эффектов релаксационной дисперсии в кристаллическом убиквитине. С помощью программы SHIFTX мы проиллюстрировали искомый эффект, источником которого явился не только конформационный обмен, но также и качательное движение молекул убиквитина с сопутствующими изменениями в наборе кристаллических контактов. Мы планируем дальнейшее изучение кристаллов, содержащих точечные мутации, имея в виду использование метода МД для предсказания мутаций, понижающих амплитуду качательного движения и тем самым улучшающих условия для рентгенодифракционного анализа. Проект 6. Мы обнаружили ранее не описанную линейную конфигурацию для взаимодействия между ε-амино группой в боковой цепи лизина и карбонилом основной белковой цепи. Анализ структурных данных PDB выявил статистически значимое присутствие подобной конформации. Расчёты методом DFT, проведенные в модельной системе катион метиламмония – N-метилацетамид в окружении, имитирующем водный раствор, показали, что это взаимодействие обладает стабилизирующей энергией ок. 2 ккал/моль. В этом отношении исследуемое нами взаимодействие существенно уступает стандартной водородной связи, однако при этом способно успешно дополнять образуемые NH3+ группой водородные связи. По результатам проведенных исследований опубликовано/принято в печать 4 работы, сделано 5 устных и 8 стендовых докладов на международных конференциях. Две статьи по материалам проекта находятся на рецензировании в журналах Scientific Reports и Nature Communications.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект 1. В данном проекте нас интересует поведение белков под воздействием окислительного стресса. На примере РНК-распознающего домена RRM2 нейропатологического белка TDP-43 мы показали, как окисление ведёт к формированию межмолекулярных дисульфидных мостиков, что в свою очередь вызывает переход в разупорядоченное состояние, агрегацию и протеолитическое расщепление белка. Как выяснилось, формирование дисульфидных мостиков само по себе не приводит к нарушениям в структуре белка. Однако дисульфид-связанный димер утрачивает способность к спонтанному фолдингу - иными словами, после значительной тепловой флуктуации такой димер не способен восстановить свою исходную структуру. В результате сшитые дисульфидными связями пептидные цепи переходят в разупорядоченное состояние и образуют агрегатные частицы. При этом устанавливается динамическое равновесие между глобулярной формой белка и агрегатами; это равновесие контролируется обменной реакцией тиол-дисульфид. Сходная картина наблюдается также и для других белков, подвергающихся воздействию окислительного стресса - например, для SH2 домена тирозинкиназы Fyn. В качестве следующего шага мы исследовали последствия образования дисульфидного мостика между белком и его природным пептидным лигандом, в последовательность которого для этой цели вводится цистеин. Проведенные нами эксперименты показали, что ковалентный комплекс Fyn SH2 домена и фосфопептида FynC, несущего мутацию G7C, испытывает эффект частичной дестабилизации и теряет растворимость, однако при этом сохраняет свою структурную целостность. Эти наблюдения подкрепляют нашу гипотезу о том, что дестабилизирующий эффект ненативных дисульфидных мостиков связан с тем, что они снижают способность белков к спонтанному (ре)фолдингу. Проект 2. Метод МД практически не располагает средствами для того, чтобы моделировать процесс образования ковалентных связей в ходе свёртывания или развёртывания белков. В данном проекте мы разработали простой эмпирический алгоритм для моделирования окислительного фолдинга, позволяющий в значительной мере восполнить этот недостаток. Усовершенствованная версия этого алгоритма была протестирована на пептидном гормоне гуанилин и прогормоне прогуанилин. В частности, в новой версии алгоритма мы предусмотрели возможность для регулирования скорости химической реакции. Таким образом было обеспечено выполнение условия, согласно которому формирование дисульфидных мостиков носит медленный характер по сравнению с конформационной динамикой гуанилина. В процессе моделирования нам удалось получить структурную модель изомера 2(B) гуанилина, значительно превосходящую по качеству соответствующую экспериментальную структуру (как выяснилось, в экспериментальных исследованиях использовался укороченный вариант пептида, что привело к искажениям нативной укладки). Используя аналогичный алгоритм, мы воспроизвели процесс образования дисульфидного мостика между SH2 доменом протоонкогенной тирозинкиназы Fyn и фосфопептидом FynC-C, содержащим специально сконструированную мутацию G7C. Таким образом нам удалось предсказать противоопухолевую активность пептида FynC-C, впоследствии получившую подтверждение в клеточных экспериментах (см. ниже). Наконец, мы разработали более общий алгоритм, позволяющий моделировать образование ковалентных комплексов между белками и их пептидными лигандами, несущими ту или иную реакционноспособную группу (например, N-сукцинимидил). Новая методика включает в себя расчёт параметров силового поля для нестандартных молекулярных фрагментов, выполняемый с помощью методов квантовой химии. Используя этот подход, нам удалось построить МД модели для конъюгации пептидных лигандов с белками, представляющими собой важные мишени для лекарственной терапии рака, такими как EGFR и Mdm2. Проект 3. В качестве исходной задачи проекта мы исследовали механизм цитотоксической активности цистеин-содержащих пептидов семейства GO. Мы доказали, что вопреки общепринятой интерпретации эти пептиды нельзя рассматривать, как ингибиторы димеризации эпителиального гликопротеина муцин 1. На самом деле механизм их цитотоксичности скорее всего связан с их активностью в качестве дисульфид оксидоредуктаз. За истекший период нам удалось уточнить ряд деталей этого механизма для пептидов GO и разработанных нами на их основе более эффективных пептидов DO. Как было показано, цитотоксическое действие данных пептидов реализуется через эндоцитоз и, по всей видимости, связано с их активностью в качестве дисульфид оксидаз/изомераз, но не редуктаз. Нельзя исключать также, что эти пептиды выступают в роли ковалентных (дисульфид-связанных) лигандов остающихся неизвестными белковых мишеней; для идентификации мишеней предпринимаются специальные опыты с использованием биотинилированных пептидов и последующим анализом изолированной белковой фракции методом масс-спектрометрии. При обработке пептидами DO клеток гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 мы наблюдали ярко-выраженные изменения в их морфологии. Как выяснилось, эти изменения связаны с деградацией актинового цитоскелета и увеличением фибронектиновой компоненты внеклеточного матрикса; однако их первопричиной является в данном случае катионный домен трансдукции. Попытка импортировать DO пептид в раковые клетки, используя специальные таргетные последовательности, не увенчалась успехом ввиду низкой эффективности такого метода доставки. Это побудило нас перейти к разработке нового класса пептидов, рассматриваемых нами как прототипы для терапевтических препаратов. В основу дизайна были положены кристаллографические структуры комплексов пептид-белок, находимые в базе данных PDB. Автоматизированный анализ PDB совместно с мета-базой генетических данных KEGG позволил выявить ряд подобных структур, представляющих непосредственный интерес с точки зрения противоопухолевой терапии. Для дальнейшей работы были отобраны те структуры, где имеется возможность для создания ковалентной связи между должным образом модифицированным пептидным лигандом и его белковой мишенью. Используя этот подход, мы разработали ковалентные пептидные ингибиторы для нескольких протоонкогенных белков: тирозинкиназы Fyn, белка-адаптера Grb2, рецептора эпидермального фактора роста EGFR (HER1) и регулятора опухолевого супрессора p53 Mdm2. В двух первых случаях нам уже удалось продемонстрировать противоопухолевую активность новых пептидов, которая, как было установлено, прямо связана с их способностью ковалентно связывать свои белковые мишени. Проект 4. В этом проекте мы использовали методы экспериментального ЯМР и МД моделирования для исследования конформационной динамики разупорядоченных белков на примере N-терминального фрагмента гистона H4. Мы установили, что данные МД моделирования с использованием новой специализированной модели воды TIP4P-D находятся в хорошем согласии с результатами наших релаксационных измерений в широком диапазоне температур. Удостоверившись таким образом в реалистичном характере МД траекторий, мы подвергли их тщательному изучению. При этом были выявлены две основные динамические моды с характерными временами ок. 100 пс и 1 нс. Для дальнейшего анализа мы параметризовали данные МД таким образом, чтобы выделить вклад в спиновую релаксацию от скачкообразных конформационных переходов (прыжков) в основной цепи пептида. В свою очередь это позволило разобраться в природе обнаруженных нами динамических мод. Как выяснилось, в случае богатого глицином гибкого участка пептидной цепи обе моды отражают в основном эффект прыжков. С другой стороны, в случае менее подвижного участка, содержащего остатки с объёмными боковыми цепями, обе моды связаны в первую очередь с относительно малыми флуктуациями торсионных углов. Таким образом нам удалось установить природу движений, ответственных за спиновую релаксацию в разупорядоченной белковой цепи. Проект 5. В данном проекте мы использовали метод МД моделирования в сочетании с экспериментами твердотельного ЯМР и кристаллографическими данными (сотрудничество с Институтом структурной биологии в Гренобле) для изучения динамики в различных кристаллических формах убиквитина. В первую очередь мы сосредоточились на исследовании так называемого "качательного движения", т.е. малых ориентационных флуктуаций белковых молекул в кристаллической решётке, и на конформационных переходах, регистрируемых в β-повороте на участке последовательности 51-54. Основываясь на полученных данных, мы предположили, что между этими двумя динамическими процессами существует причинно-следственная связь. В качестве следующего шага мы предложили точечную мутацию, К11А, которая по нашим предсказаниям должна была уменьшить амплитуду обеих динамических мод в кристалле 3N30 и тем самым продемонстрировать их взаимосвязь. Однако наше предположение подтвердилось лишь в отношении локальной динамики. Что же касается качательного движения, то дополнительные данные МД моделирования, равно как и экспериментальные измерения, не выявили ожидаемых изменений в кристалле, несущем мутацию К11А. Этот результат не опровергает выдвинутой нами гипотезы, которая носит достаточно общий характер, но указывает на то, что подтвердить эту гипотезу с помощью точечного мутагенеза будет весьма затруднительно. Для того, чтобы лучше оценить эффект точечных мутаций в этом контексте, мы дополнительно исследуем кристаллы, несущие мутацию G53A. Проект 6. В этом проекте нами был исследован ранее не описанный структурный мотив, в котором NH3+ группа боковой цепи лизина взаимодействует с карбонильной группой основной цепи белка. Это взаимодействие характеризуется линейным расположением атомов, при котором кислород располагается на оси симметрии NH3+ группы (угол C-N•••O ок. 180°), и дополняет набор стандартных водородных связей, образуемых NH3+ группой (угол C-N•••O ок. 109°). Детальные расчёты методом DFT показали, что отдельно взятое линейное взаимодействие соответствует седловой точке на поверхности потенциальной энергии; в отсутствие внешних ограничений это взаимодействие переходит в стандартную водородную связь. Однако если водородные связи заняты другими донорами, то седловая точка трансформируется в истинный минимум глубиной ок. 2 ккал/моль. Таким образом, ε-аммонийная группа, образующая три водородные связи и в дополнение к этому линейное взаимодействие, полностью реализует свой потенциал в отношении взаимодействия с белковым окружением. Дополнительные расчёты, проведенные методом DFT, предсказали наличие детектируемого спин-спинового взаимодействия между атомами 15N и 13C в рассматриваемой нами линейной конфигурации. Однако предпринятые нами попытки измерить соответствующую константу экспериментально, используя образец полиаденин-связывающего белка (PABP), не увенчались успехом из-за быстрого обмена протонов NH3+ группы с растворителем и других технических сложностей. В этой ситуации мы прибегли к расчётам с применением метода натуральных связевых орбиталей для того, чтобы охарактеризовать природу линейного взаимодействия. Как было показано, это взаимодействие носит преимущественно электростатический характер, и лишь в очень малой мере – ковалентный. Анализ банка данных PDB выявил ок. 12,000 примеров линейного взаимодействия в белках, включая ряд примеров, представляющих значительный интерес с точки зрения структурной биологии. В частности, устойчивое линейное взаимодействие было обнаружено в P-петле известного протоонкогенного белка Ras, где оно задействует консервативный лизин К16. Помимо этого нам удалось идентифицировать определённые структурные мотивы с высокой встречаемостью линейного взаимодействия. К примеру, было показано, что линейное взаимодействие играет заметную роль в стабилизации C-терминального конца α-спиралей.