Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект направлен на изучение филогенетических отношений между видами группы Anоpheles maculipennis из Северной Америки и Евразии на основе молекулярного анализа кодирующей части генома и цитогенетического анализа порядка генов. Альтернативные подходы позволят получить комплексное представление об эволюционной истории этих малярийных комаров. Знания о том, как происходили эволюционные изменения, связанные с экологической адаптацией и развитием восприимчивости к патогенам у переносчиков заболеваний, помогут понять, как подобные изменения будут происходить в будущем. Для молекулярно-филогенетического анализа нами была проведена работа по получению последовательностей транскриптомов малярийных комаров. Мы выделили образцы тотальной РНК из двух видов комаров - представителей разных континентов: An. quadrimaculatus, обитающего в восточных штатах США, и популяций An. messeae, собранных в Европейском и Азиатском регионах России. Выделенная тотальная РНК имела высокую концентрацию и не имела признаков деградации. Последовательности транскриптомов An. messeae и An. quadrimaculatus, полученные на платформе Illumina, будут использованы для реконструкции филогении видов комаров рода Anopheles. Для установления филогенетических связей в группе Maculipennis при помощи анализа порядка генов и точек разрывов фиксированных хромосомных инверсий осуществили картирование референсного генома An. atroparvus на хромосомах этого вида. Мы разработали физическую карту с координатами 50 суперконтигов генома этого вида, которые соответствуют ~90% генома An. atroparvus. Физическая карта была построена на основе политенных хромосом из питающих клеток яичников An. atroparvus с использованием флуоресцентной in situ гибридизации. Наши исследования гомологии хромосомных плеч между An. atroparvus и An. gambiae выявили перетасовку аутосомных плеч между этими двумя видами. Физическая геномная карта An. atroparvus будет способствовать исследованиям по сравнительной и эволюционной филогеномике рода Anopheles. Мы проанализируем участки генома, в которых в ходе эволюции членов группы Maculipennis происходят инверсионные разрывы хромосом, и сравним их с местами разрывов у видов за пределами данной группы. Такой подход позволит нам выявить древний и современный порядок генов с целью построения филогении на основе хромосомныx инверсий. http://tsu.ru/science/orntd/uchastie-v-konkursakh-rossiyskogo-nauchnogo-fonda/

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Хромосомные фото-карты высокого разрешения являются необходимыми для объективного сравнительного анализа последовательностей хромомерного рисунка, а также документирования локализации нуклеотидных последовательностей ДНК с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). В рамках настоящего проекта хромосомные карты необходимы для документирования локализации точек разрывов фиксированных (видоспецифичных) хромосомных перестроек и реконструкции филогенетических взаимоотношений в комплексе Maculipennis. Нами были разработаны хромосомные карты для трех видов малярийных комаров An. sacharovi, An. messeae и An. beklemishevi. С целью разработки хромосомных карт An. sacharovi была организована экспедиция в Армению. Материал для хромосомных карт An. messeae и An. beklemishevi был собран в Томской области (с. Чаинск, с. Кандинка, с. Ярское). Идентификация видов проводилась с помощью цитогенетического анализа хромосом трофоцитов яичников. Для приготовления хромосомных карт фиксировали яичники в растворе Карнуа (этанол:уксусная кислота, 3:1). Материал помещали на предметное стекло в каплю 50% пропионовой кислоты, оставляли на 10 минут, накрывали покровным стеклом и раздавливали. Хромосомы анализировали при увеличении 100х в фазовом контрасте под микроскопом Axioimager A1 (Zeiss, Германия). Цифровые изображения политенных хромосом размером 2584х1936 пикселей и разрешением 150 пикселей на дюйм получали с использованием CCD-камеры Mr5 (Zeiss) и программного обеспечения AxioVision 4.8.1 (Zeiss, Германия). В этой программе также проводили измерение длин хромосомных плеч в не менее чем 10 ядрах трофоцитов яичников. Для приготовления хромосомной карты отбирали высококачественные изображения расположенных вне ядер, отдельно лежащих, расправленных, с четким дисковым рисунком хромосом и обрабатывали в программе Adobe Photoshop CS6. Хромосомы «вырезали», освобождая от лишних участков изображения и «выравнивали», «вырезая» и «склеивая» небольшие участки хромосомы последовательно один за другим от теломерам к центромерам. Комбинировали наиболее удачные районы отдельно выровненных хромосом и «подрезали» контур. Хромосомные плечи были поделены на 39 районов, в соответствии с делением на районы хромосом у других видов малярийных комаров. Кроме линейной организации хромосом, пространственная организация хромосом в ядре может быть информативным признаком для различения видов малярийных комаров. Мы провели детальный анализ особенностей объема и формы X-хромосомы и ядрышка клеток фолликулярного эпителия и трофоцитов яичников Anopheles atroparvus с применением новейших средств анализа. Для экспериментов были использованы малярийные комары An. atroparvus. Материалом для микродиссекции и 2D-FISH служили фиксированные в растворе Карнуа (75% этанол, 25% уксусная кислота) яичники. Материал для 3D-FISH выделяли непосредственно перед проведением гибридизации из 3 особей An. atroparvus. Методом микродиссекции получали ДНК-пробу X-хромосомы, который служил матрицей для degenerate oligo primer (DOP)-амплификации флуоресцентно-меченного зонда. Полученный зонд гибридизовали с недавленными препаратами яичников комаров методом 3D-FISH. Ядрышко окрашивали при помощи флюорeсцентных антител к фибрилларину. Полученные с помощью конфокального микроскопа LSM 780 (Carl Zeiss) и программного обеспечения ZEN 2012 (Carl Zeiss) серии снимков-срезов ядра были обработаны и проанализированы с помощью Fiji (ImageJ), комплекса инструментов для анализа пространственной организации ядра TANGO (http://biophysique.mnhn.fr/tango/measuregeometrical) и базы данных MongoDB (MongoDB, Inc. n.d.). На этапе преобработки использовался фильтр «Mean» из плагина для ImageJ «Fast Filters 3D» и фильтр «Gaussian Blur 3D» из плагина для ImageJ «Misc Filters 3D». Для сегментации сигнала на изображениях использовался классический алгоритм (thresholding) встроенный в плагин для ImageJ «Hysteresis Segmenter». С помощью инструментов из плагина для ImageJ “Simple Measure Geometrical” для каждого ядра были проведены пространственные измерения, которые и использовались в статистическом анализе. Mы изучили тканеспецифичные аспекты формы и размера политенных хромосом, а также динамику хромосом во время роста ядер. Пространственные характеристики Х-хромосомы и ядрышка у An. atroparvus будут служить в качестве основы для аналогичных исследований у других видов комплекса Maculipennis, к которому An. atroparvus принадлежит. Будущие исследования рассмотрят видоспецифичные аспекты ядерной архитектуры. Изучение эволюции структуры ядра позволит оценить возможность использования некоторых особенностей 3D организации генома в качестве маркеров для понимания филогенетических отношений в пределах данного видового комплекса. Mы провели сравнение линейной организации геномов An. albimanus, который является внешнeй группой для комплекса Maculipennis, An. atroparvus, который относится к комплексу Maculipennis, и An. gambiae, который является референсным видом. Эти геномные сравнения показали, что положение центромеры изменялось в ходе полно-плечих перестроек в процессе эволюции комаров. Многочисленные "полно-плечие" транслокации нарушили целостность хромосомных плеч вблизи центромер и локально перетасовали прицентромерные последовательности между различными хромосомными элементами. Эти данные должны быть учтены при реконструкции филогении в комплексе Maculipennis на основе фиксированных инверсий. Для того, чтобы исследовать характер хромосомных перестроек между видами, находящимися на меньших эволюционных расстояниях, мы провели BLAST-поиск гомологичных последовательностей между геномами An. atroparvus (комплекс Maculipennis), An. lesteri и An. sinensis (группа An. hyrcanus). Данный анализ продемонстрировал хорошее соответствие хромосомных плеч, отсутствие полно-плечих транслокаций и наличие перетасовки порядка генов при помощи парацентрических инверсий между этими видами комаров. Сравнительные цитогенетические и физические геномные карты представителей комплекса Maculipennis и группы An. hyrcanus являются полезными инструментами для реконструкции филогении в комплексе Maculipennis на основе порядка генов с использованием внешней группы. В 2016 году проведена работа по получению последовательностей транскриптомов малярийных комаров An. beklemishevi, An. labranchiae, An. maculipennis и An. freeborni. Некормленных кровью самок и самцов Anopheles, мы фиксировали в RNAlater для предотвращения деградации РНК. Тотальная РНК была выделена из 10 отдельных особей для каждого из четырех видов. Был использован PolyA метод и произведен контроль качества секвенируемой библиотеки РНК, включая оценку размера при помощи биоанализа и количественным путем. Секвенирование транскриптомов было произведено при помощи HiSeq v4 1x125bp. Было получено 300 млн. прочтений с общим количеством данных - 37.5 Gb. Транскриптомы видов, просеквенированных в 2016 г. (An. beklemishevi, An. labranchiae, An. maculipennis, An. freeborni), транскриптомы видов, просеквенированных в 2015 г. (An. daciae Moscow, An. daciae Tomsk, An. messeae Moscow, An. quadrimaculatus), вместе с геномами An. atroparvus и An. sinensis (как внешней группы) были использованы для последующего филогенетического анализа.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В данном проекте были разработаны хромосомные карты высокого разрешения для малярийных комаров и картированны геномы с использованием флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Нами были разработаны цитогенетические карты высокого разрешения для An. freeborni и An. quadrimaqulatus и были картированы точки разрывов хромосомных перестроек у этих видов. Мы также построили цитогенетическую карту Anopheles beklemishevi. Карта была разработана с использованием цифровой обработки изображений высокого разрешения из комаров собранных в природе. Полиморфизм хромосомных инверсий был определен в 13 географически отдаленных популяциях An. beklemishevi. Было обнаружено четыре высокополиморфных широко распространенных инверсии. Позиции общих хромосомных инверсий были указаны на карте. Мы построили высококачественную стандартную фотокарту для политенных хромосом из питающих клеток яичников An. sacharovi для дальнейшего физического картирования генома. Эта карта поможет осуществить детальную сборку генома на основе хромосом, которая может быть использована для разработки геномных методов контроля комаров. Мы картировали 89.6% генома на хромосомах Аn. atroparvus. Окончательная карта состоит из 56 упорядоченных геномных скэффолдов. Сравнительный геномный анализ с An. gambiae и An. albimanus обнаружил множественные транслокации генетического материала перицентромерных областей аутосом, которые разрушают целостность хромосомных элементов в эволюции Anopheles. Новая сборка генома AatrE2, привязанная к хромосомам An. atroparvus, находится в открытом доступе на VectorBase (https://www.vectorbase.org/organisms/anopheles-atroparvus/ebro/aatre2). Это уже вторая картированная геномная сборка для малярийных комаров, поддержанная проектом РНФ. Новая геномная сборка An. albimanus AalbS2 была выставлена на VectorBase ранее (https://www.vectorbase.org/organisms/anopheles-albimanus/stecla/aalbs2). Для полногеномного мультигенного филогенетического анализа, основанного на множественном выравнивании белок-кодирующих последовательностей, мы выделили тотальную РНК и ДНК из нескольких видов из подгруппы Maculipennis. Самки и самцы Anopheles были зафиксированы либо в Trizol для предотвращения деградации РНК либо в этаноле. Тотальная РНК или ДНК была выделена из 40-50 отдельных особей. РНК была очищена стандартным фенол-хлороформным методом, растворена в свободной от РНКазы воде и хранилась при -80°C. Тотальная РНК и ДНК были секвенированы на платформе Illumina. Был использован PolyA метод и произведен контроль качества секвенируемой библиотеки РНК, включая оценку размера при помощи биоанализа и количественным путем. Контроль качества прочтений был произведен с использованием Fastqc, а тримминг - программным обеспечением Trimmomatic (Bolger et al. 2014). Сборка транскриптомов осуществлялась с помощью программного обеспечения Trinity (Haas et al. 2013) с опцией цепь-специфичности. Извлечение кодирующих ДНК последовательностей (CDS) из унитигов и их аннотация были произведены с использованием BLASTP против пептидов из 24 геномов комаров из VectorBase (https://www.vectorbase.org). Только самые длинные CDS от каждого унитига с BLASTP хитами были сохранены для анализа. Ортологи были выявлены с использованием Orthofinder (Emms et al. 2015). Мы также секвенировали геномы An. messeae и An. daciae из разных популяций Московской и Томской областей и ITS2 фрагменты видов из северо-Американской подгруппы Maculipennis. Мы реконструировали филогению просеквенированных геномов An. messeae и An. daciae из популяций Московской и Томской областей. Оказалось, что виды группируются по-разному в зависимости от хромосомной локализации сиквенсов. Филогенетическое древо на основе Х хромосомы группирует вместе популяции Московской и Томской областей, но разделяет их по видам. Напротив, филогенетическое древо на основе аутосом группирует вместе An. messeae и An. daciae, но разделяет их по Московской и Томской областям. Для реконструкции исторической взаимосвязи между Североамериканскими и Евразийскими комарами, мы провели мультигенный филогенетический анализ 9 Палеарктических и 2 Неарктических видов на основе полученных транскриптомов и геномов, используя 1273 ортологов для каждого плеча аутосомы и Х хромосомы. Филогенетический анализ показал, что An. beklemishevi ближе к Палеарктическим представителям группы, чем к Неарктическим. Интересно, что высокополиморфные по хромосомным инверсиям виды An. messeae и An. beklemishevi расположены соответственно в основании и в конце филогенетического древа. В то время как хромосомно-мономорфные виды имеют промежуточное положение на филогенетическом древе. Кроме того, кластер An. beklemishevi более близок к An. freeborni, обитающем на Западе Соединенных Штатов, чем к An. quadrimaculatus, виду с Востока Соединенных Штатов. Наше филогенетическое древо однозначно свидетельствует в пользу единственной миграции комаров группы Maculipennis из Северной Америки в Евразию, за чем следовало их дальнейшее разделение на азиатскую и европейскую клады. Таким образом, наш филогенeтический анализ обнаружил наличие 4 основных клад в подгруппе Maculipennis: 1) An. beklemishevi, 2) Аn. sacharovi и Аn. martinius, 3) An. atroparvus и Аn. labranchiae, 4) An. artemievi, Аn. maculipennis, An. messeae и Аn. daciae. Реконструкция филогении и современное распределение видов поддерживают единственную миграцию комаров Maculipennis из Северной Америки в Евразию. Филогенетические данные показывают, что An. beklemishevi относится к Палеарктической подгруппе Maculipennis.