Аннотация результатов, полученных в 2014 году
1. Впервые получен и проанализирован транскриптом нервной системы легочного брюхоногого моллюска Helix lucorum taurica L.. Анализ транскриптома выявил гены-гомологи известных генов позвоночных животных, включая ген болезни Альцгеймера (пресенилин). Проводится детальный анализ транскриптома. 2. Методом полногеномного секвенирования (транскриптом) получены данные по дифференциальной экспрессии генов в нервной системе наземной улитки. Целью экспериментов был поиск немедленных ранних генов (НРГ), активность которых может служить маркером активации нейронной сети при физиологических нагрузках. Всего проведено 3 больших серии экспериментов, направленных на поиск немедленных ранних генов у беспозвоночных. Для улучшения сборки транскриптома за счёт уменьшения вариабельности, каждая ЦНС разрезалась пополам: половина служила контролем (томозилась активность), другая половина подвергалась экспериментальным воздействиям. В одном из экспериментов для анализа выделялась только небольшая ростральная часть париетальных ганглиев, содержащая несколько десятков нейронов и гигантские идентифицированные командные нейроны оборонительного поведения улитки, причем опять контролем служила симметричная часть такого же ганглия с такими же нейронами. Эта серия сделана в попытке исследовать небольшие образцы нервной ткани. Результат полногеномного РНК-секвенирования — транскриптомный профиль под экспериментальным воздействием. Анализ дифференциальной эксрессии (ДЭ) в пакете DeSeq выявил 417 статистически значимых (p<0.05, FDR<0.05, abs(logFC>2)) контига ДЭ хотя бы в 1 из экспериментов. Профиль ДЭ в целом обнаруживает ап-регуляцию под воздействием применённых условий (5НТ) в Эксп1 и как ап-, так и даун-регуляцию в Эксп2. Всего результирующая сборка транскриптома содержит 2065601 контигов, была проведена аннотация путём выравнивания на доступные базы данных 6 организмов (C.elegans, Drosophilia, Fugu, Aplysia, Biomphalaria, Lymnaea). Из 417 ДЭ контигов, 68 аннотированы программой. Мы также вручную аннотировали 23 неаннотированных автоматически контига. Обнаружены гомологи НРГ c/ebp, c-fos и c-jun. Эти гомологи являются наиболее перспективными для синтеза зондов для выявления сети нейронов методом гибридизации ин ситу. Выводы: В приведенном списке есть крайне перспективные для выявления нейронных сетей гены, с которыми мы планируем работать в самом ближайшем будущем, выявляя с их помощью нейронные сети, участвующие в определенном поведении. 3. В качестве поискового исследования мы применили подход, позволяющий избирательно подвергать секвенированию только вновь образованные РНК. Набор реагентов для этой процедуры (The Click-iT® Nascent RNA Capture Kit, commercially available from Invitrogen, USA), использует Click-iT® технологию для эффективного и высокочувствительного маркирования вновь синтезированной РНК. Этот метод не модифицирован для нервной ткани. Выделенную таким образом РНК можно использовать для последующего анализа с помощью глубокого секвенирования на платформе Ion Proton. Судя по полученным данным и качеству образцов для анализа, этот метод перспективен для применения именно при физиологических воздействиях. Требуется продолжение работ. 3. Для определения того, какие именно экспрессируемые гены не только производят мРНК, но и осуществляют в рибосомах синтез белков использовался новый метод рибосомного профайлинга, который фактически даст данные о том, какие из экспрессируемых в данной клетке генов синтезируют белок, а какие нет. Определяя точное местоположение рибосом на каждой мРНК, метод рибосомного профайлинга также имеет потенциал для выявления белок-кодирующих областей. Протокол метода рибосомного профайлинга в отчетном году отрабатывался для первичных культур нейронов гиппокампа. В общих чертах, отрабатывавшийся в отчетном году протокол метода рибосомного профайлинга включает три отдельных стадии, каждая из которых может быть модифицирована под конкретные задачи. (i) Получение клеточных экстрактов, в которых рибосомы были точно остановлены вдоль цепи мРНК, как они находились in vivo. (ii) Обработка экстрактов нуклеазой для расщепления суммарной РНК которая не защищена рибосомой и последующее выделение защищенных рибосомой фрагментов мРНК. (iii) Количественное превращение защищенных фрагментов РНК в библиотеку ДНК, которая может быть проанализирована с помощью глубокого секвенирования Получены первые образцы, которые подготовлены для секвенирования на ION Proton. 4. Оптогенетические исследования. В отчетном году сверх плана предприняты попытки освоить использование современной методики стимуляции нервных клеток с помощью оптогенетического подхода. Для этого эмбрионы мышей были трансфицированы in utero конструктом, содержащим две плазмиды, одна из которых кодировала ген красного флуоресцентного белка, который метил трансдуцированные нейроны и хорошо обнаруживается в телах нейронов, тогда как вторая плазмида содержала ген ChR2, который обеспечивал возможность эффективной активации нейрона голубым светом. Перспективность оптогенетических подходов применения физиологических стимулов в сочетании с геномикой небольших частей нервной системы не вызывает сомнений. Требуется продолжение экспериментов.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проведена верификация геномных данных по кандидатам в ранние гены. Из 12 синтезированных зондов только три селективно окрашивали нейроны в ЦНС виноградной улитки (гомологи c/ebp, c-fos, c-jun). В норме выявлялось незначительное число нейронов (10-15) в церебральных ганглиях и подглоточном комплексе ганглиев. При общей неспецифической активации нейронов выявлялась экспрессия в большинстве нейронов ЦНС. Определены оптимальные временные и концентрационные параметры для эффективной дифференциальной гибридизации ин ситу для получения избирательной реакции нейронов по 3 из 12 синтезированных зондов при времени воздействия меньше 30 минут. Проведенные эксперименты показали возможность выявления функциональных сетей нейронов улитки. Впервые на нейронах показана возможность использовать технологию захвата новосинтезированной РНК из уже существующего пула РНК с помощью Click-it® химии. Были установлены сроки включения ЭУ в нейроны. Установлено, что интенсивность синтеза РНК, оцениваемая по времени реакции и ее интенсивности, варьирует от нейрона к нейрону. Доказано, что ЭУ селективно включается в РНК нейронов улитки. Различие в интенсивности и времени реакции между различными идентифицированными нейронами предполагает возможность избирательной реакции на стимулирующие воздействия, в том числе связанные с активацией ранних генов. С использованием метода Click-it Nascent RNA capture, была получена фракция новосинтезированной РНК нейронов улитки, которая была использована для получения кДНК для последующего полногеномного секвенирования. Среди выявленных генов 327 являются up-регулируемыми, и 1135 являются down-регулируемыми. Идентификацию дифференциально экспрессирующихся транскриптов осуществляли с помощью программы Blast2GO. Из 1462 дифференциально экспрессирующихся транскриптов 589 (40,3%) имели значимые BLASTX совпадения. Использовались данные генома водного моллюска Aplysia californica, наиболее изученному близкородственному виду, всего было идентифицировано 285 генов. Рибосомный профайлинг основан на глубоком секвенировании мРНК фрагментов, защищеных рибосомой, что позволяет контролировать и оценивать трансляцию с глубиной, скоростью и точностью, сравнимой с альтернативными существующими подходами. С целью проведения эффективного рибосомного профайлинга мы провели отработку метода получения фракции синаптосом из нейронов гиппокампа крысы с последующей активацией синаптосом с помощью глютамата и глицина или KCl. Получение синаптосом с помощью метода ультрацентрифугирования в градиентах плотности перколла и Opti-Prep оказалось более качественным. Отрабатывается получение кДНК-библиотек из фракции полисом для последующего глубокого секвенирования. Для изучения механизмов синаптической пластичности была предложена методика оптогенетической стимуляции множества пресинаптических нейронов, синаптические входы которых конвергируют на одну единственную постсинаптическую клетку. Освоена методика получения трансгенных крыс путем инъекции плазмиды, содержащие ген каналородопсина2, в мозг эмбрионов на 16й день внутриутробного развития и электропорации мозга эмбрионов. Электрофизиологические эксперименты, поставленные на срезах мозга полученных этим путем животных показали эффективность применяемой методики и возможность исследования механизмов моносинаптической пластичности с использованием избирательной оптической активации пресинаптических нервных клеток. Стабильность входных стимулов в этой парадигме качественно выше, чем при стандартной методике электрической стимуляции афферентных волокон. Одним из необходимых элементов синаптической пластичности является убиквитин-зависимая деградация белков в протеасомах, которая позволяет локально и в строго определенное время элиминировать заранее определенные белки-мишени для возможности последующего преобразования молекулярных комплексов. Чтобы проверить гипотезу о роли оксида азота в регуляции локального убиквитин-зависимого распада белков, мы экспрессировали в нейронах генетически-кодируемый сенсор убиквитин-зависимой деградации белков. Эксперименты, проведенные с данной конструкцией, показали, что донор оксида азота SNAP не влияет на активацию протеасом, что может быть связано как с недостаточностью концентрации нитроксида в нужных областях нейрона, так и со свойством нитроксида разрушать белки. Чтобы исключить влияние синтеза нового белка на общую флуоресценцию во время эксперимента, в настоящее время проводится работа по созданию генетической конструкции, в которой вместо GFP будет вставлен флуоресцентный белок Dendra, что позволит позволит отдельно следить за судьбой вновь синтезируемых белков и ранее синтезированных.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
(1) В отчетном году проведена визуализация активности протеасом, необходимых для пластических изменений, в разных физиологических условиях в нейронах первичных культур позвоночных с новой генетической конструкцией на основе белка Dendra, сшитого с убиквитином. Проведено исследование дифференциальных изменений экспрессии генов (транскриптом) в культуре нейронов позвоночных в покое и при активации нейронов (физиологическая нагрузка). Предварительный анализ выявил увеличение экспрессии мРНК Arc в 15 раз, в 6 раз –Fos, в 32 раза –FosB, в 100 раз –Npas4 Опубликована статья по исследованию влияния оксида азота на протеасомную деградацию белков в нейронах (Bal N, Roshchin M, Salozhin S, Balaban P. Nitric Oxide Upregulates Proteasomal Protein Degradation in Neurons. Cell Mol Neurobiol. 2016 Aug 5. DOI: 10.1007/s10571-016-0413-9). (2) Успешно апробирован новый метод визуализации активации функциональных нейронных сетей с помощью клик-ит технологии на классическом нейробиологическом объекте Helix lucorum. Метод выявления вновь синтезированной РНК в нейронах улитки (Click-iT метод) заключается в том, что ЦНС животного после физиологических нагрузок инкубируется в течение определенного времени в растворе этинил-уридина (модифицированный аналог тимидина), который встраивается только во вновь синтезируемую РНК. В итоге реакции можно видеть флуоресцентное свечение (зеленое или красное в зависимости от используемой в реакции метки) в ядрах тех клеток, где за время инкубации в растворе этинил-уридина происходил количественно детектируемый синтез РНК. Результаты проведенных опытов свидетельствуют, что этинил-уридин включается в РНК, но не включается в ДНК. Следовательно, наблюдаемая метка в нейронах действительно связана с синтезом РНК. Наши эксперименты показали, что два метода (Click-iT реакция выявления РНК и метод гибридизации in situ) потенциально совместимы. Таким образом, модифицируя состояние ЦНС, можно добиться раннего выявления вновь синтезированной РНК Click-iT методом, что позволяет потенциально использовать его для выявления экспрессии ранних генов, в том числе проводить на одних и тех же препаратах как выявление тотальной вновь синтезированной РНК, так и избирательной РНК, относящейся к работе какого-либо из ранних генов (метод гибридизации in situ). Опубликована статья о скоростях синтеза новой РНК у беспозвоночных и особенностях работы с Click-iT методом. (Ierusalimsky VN, Balaban PM. RNA synthesis and turnover in the molluscan nervous system studied by Click-iT method. Brain Res. 2016 Feb 15;1633:139-48. doi: 10.1016/j.brainres.2015.12.049) (3) Получены новые данные о принципиально новых подходах к исследованию механизмов синаптической пластичности с помощью оптогенетических методов. Убедительно показано, что оптогенетические методы могут быть эффективно использованы для изучения пластических эффектов внутриклеточной тетанизации на разные синапсы одной постсинаптической клетки. В частности, такой подход позволяет выявить молчащие синапсы, а так же депрессию и потенциацию в разных синапсах в ходе одного эксперимента. Подробный анализ результатов экспериментов с фотостимуляцией пресинаптической нейрональной сети показал, что в большинстве случаев результаты одного эксперимента достаточны для определения достоверной корреляции между индексом парной стимуляции и амплитудой изменения синаптических ответов после потенциации. При использовании традиционных методов синаптической стимуляции для получения достоверной корреляции между этими параметрами требовалось, как правило, не менее двадцати экспериментов. Готовится статья по исследованию механизмов гетеросинаптической фасилитации оптогенетическими методами. (4) Получены новые данные об эффективности существующих подходов получения библиотек кДНК от отдельных нервных клеток, проведен сравнительный анализ профилей экспрессии «обученных» и «необученных» одиночных нейронов моллюска. Сравнительный анализ методов получения библиотек кДНК одного идентифицированного нейрона моллюсков позволил разработать модификацию существующих технологий и получить список генов, дифференциально экспрессирующихся при физиологической нагрузке, применяемой для активации долговременных пластических изменений в нервной системе. Для первой временной точки (спустя двадцать минут после "обучения") было показано, что изменяется экспрессия 850 генов. Из них было аннотировано 303 (таблица «А» во вложении). Стоит особо обозначить еще один момент. Для гена белка atypical protein kinase Мzeta, который широко известен, как ключевой элемент пластичности и поздний ген, результаты анализа для временной точки «20 минут» после "обучения", и для точки «2 часа» показали уменьшение экспрессии мРНК, при этом абсолютные значения изменений были схожими (для точки «20 минут» LogFC=-6.977, для точки «2 часа» LogFC=-8.280). Детальный анализ характера выявленных генов приведен в полном отчете. Частично полученные данные и анализ подходов опубликованы в статьях, поддержанных грантом (Бородинова, и др. Роль атипичных протеинкиназ в поддержании долговременной памяти и синаптической пластичности. Биохимия, 2017, т.82, №2; Чеснокова Е.А., Колосов П.М. Локальный синтез белка в дендритных окончаниях и способы его регуляции в норме и при пластических изменениях. Журнал высшей нервной деятельности. 2016. – Т. 66. № 2. – С. 163-180; Deryabina et al. Serotonin Application Effects on Electrical Characteristics of the Premotor Interneurons in Intact and Trained Snails. BioNanoSci. December 2016, V. 6, Issue 4, pp 269–271). (5) Получены принципиально новые данные о механизмах хранения и регуляции памяти на молекулярном уровне путем исследования путей ингибирования трансляции мРНК PKMζ . Отсутствие регуляторной субъединицы у этой атипичной протеинкиназы привело к тому, что протеинкиназа М зета активна без дополнительной активации через кальций-чувствительные домены, и регуляция активности протеинкиназы М зета осуществляется в первую очередь за счет регуляции ее синтеза, и в меньшей степени – за счет фосфорилирования. Еще в первых работах было предположено, что в неактивных нейронах осуществляется подавление синтеза PKM zeta за счет ингибирования трансляции. Однако механизм подавления трансляции до настоящего времени точно не установлен. В ряде работ авторы выдвигают гипотезу о том, что важную роль в регуляции трансляции многих белков нервной системы, в том числе PKM zeta, играет протяженность 5’-UTR. Ранее, проведенный нами анализ последовательности 5’-UTR PKM zeta показал, что она содержит uORF, что, как показывают литературные данные, может играть важную роль в регуляции трансляции независимо от протяженности 5’-UTR. Более того, в 5’-UTR PKM zeta не одна, а сразу семь uORF, что заставляет предположить важность этих структур в регуляции трансляции именно этой мРНК. Поэтому мы решили подробно исследовать влияние ORF на эффективность трансляции PKM zeta как в бесклеточных экспрессионных системах, так и в живых культурах нейронов гиппокампа. В экспериментах на первичной культуре гиппокампа крысы мы использовали систему из двух флуоресцентных белков, один из которых находится под контролем 5’- и 3’-нетранслируемых областей PKM zeta. Второй флуоресцентный белок находился под контролем CPV-IRES-элемента (cricket paralysis virus), синтез которого не зависит от наличия факторов инициации и способен сразу привлекать 40S субчастицу для посадки на мРНК. Данный белок использовали для нормирования сигнала репортерного белка. При сравнении этой конструкции с мутантной конструкцией, в который деактивированы все ОРС путем замены стартового кодона на стоп-кодон, было обнаружено, что экспрессия флуоресцентного белка в отростках нейронов подавлена в культуре с нормальной 5’-UTR PKMzeta, но хорошо экспрессируется в культуре с мутантной PKMzeta. Синаптическая активация нейронов с помощью блокатора ГАМКА-рецепторов пикротоксином приводила к увеличению относительной флуоресценции репортерного сигнала в нейронах, содержащих нормальную последовательность 5’-UTR PKM zeta. Эти данные свидетельствуют о том, что uORF участвуют в регуляции синтеза PKM zeta в живых нейронах, а также о том, что синаптическая активность в нейронах может изменять трансляцию этого белка. По полученным данным опубликована статья (Bal et al. Upstream Open Reading Frames Located in the Leader of Protein Kinase Mζ mRNA Regulate Its Translation. Front Mol Neurosci. 2016 Oct 13;9:103. DOI: 10.3389/fnmol.2016.00103) (6) В продолжение экспериментов, проведенных в 2015 году, получены дополнительные данные о роли системы подкрепления в хранении сигнальной памяти и обстановочной аверзивной памяти у моллюсков. Показаны качественные отличия механизмов хранения этих двух комплементарных видов памяти при многократной реактивации и разная роль системы подкрепления. По полученным данным опубликована статья (Balaban et al. Impairment of the serotonergic neurons underlying reinforcement elicits extinction of the repeatedly reactivated context memory. Sci Rep. 2016 Nov 14;6:36933. doi: 10.1038/srep36933).