Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Выведена общая аналитическая формула для оценки времени преодоления длинного, изрезанного свободно-энергетического барьера в ходе последовательной химической, биохимической или физической реакции – в частности, при росте амилоидной фибриллы. На основе имеющихся структурных данных для А-бета пептида (связанного с развитием болезни Альцгеймера) были спроектированы первые варианты искусственных белков для кэпирования каждого из концов («+» и «-») растущей амилоидной фибриллы. Определены позиции в цепи А-бета пептида, появление в которых пролина должно привести к тому, что полученные мутантные белки будут способны присоединяться к амилоидной фибрилле либо именно на ее «+», либо именно на ее «-» конец, и тем останавливать её дальнейший рост в эту сторону. На белке GальфаO было проверено предположение о том, что для поиска «слабого» места в белке (влияющего на стабильность), можно использовать программы, которые определяют нативно-развернутые участки в белках. Искусственное введение SS-связей на таких участках с большей вероятностью ведет к стабилизации белка, и соответственно может повлиять на процесс амилоидообразования. На трех белках начаты исследования влияния замен аминокислотных остатков, локализованных на их поверхности, на стабильность нативного и промежуточных состояний этих белков – с целью направленного влияния, с помощью именно этих остатков, на скорости формирования и разрушения нативного состояния глобулярных белков. Разработана концепция использования пептид-связывающего N-концевого домена белка H2KD для ингибирования роста амилоидных структур. Разработана методика выделения, очистки и ренатурации этого белка. Проведены эксперименты по исследованию взаимодействия этого белка с коротким пептидом, имитирующим часть амилоидной фибриллы. Показано, что сворачивание и сборка ко-шаперонина GroES происходит на порядок быстрее сворачивания и сборки шаперонина GroEL, а промежуточное олигомерное состояние на пути сборки GroEL представляет собой однокольцевую семисубъединичную структуру, взаимодействующую с GroES. На примере взаимодействия барназы с барстар показано, что метод резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) может быть использован для регистрации белок-белковых взаимодействий in vivo. Для оценки степени влияния клеточных структур на процесс образования амилоидных агрегатов был проведён анализ экспериментальных данных о влиянии мембранной поверхности на структуру и стабильность белков. Результатом данного анализа явилось написание обзора [Бычкова и др., Успехи биологической химии, 2014]. Необходимые для экспериментов полипептиды нарабатывались в клетках E. coli в составе гибридного белка «тиоредоксин -полипептидный линкер - целевой полипептид». His-таг в линкере облегчает выделение белка при металл-хелатной хроматографии. Расположенный в линкере, прямо перед началом целевого пептида, сайт протеолиза для специфической протеазы Xa в позволяет аккуратно отщепить целевой пептид. Конструкции такого типа были получены для ряда амилоидогенных пептидов. Получены пять мутантных форм апомиоглобина. Для одного из них (V10F) определен участок полипептидной цепи, формирующий остов амилоидной фибриллы. Способность к H\D обмену, при различных pH раствора, была установлена для всех 20 канонических аминокислотных остатков. На основании этих данных теперь можно рассчитать распределение H\D для неструктурированного участка цепи.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проведен дизайн мутаций заряженных поверхностных аминокислотных остатков в K3 пептиде бета2-микроглобулина (эти мутации должны изменять стабильность и pH образования амилоидов). Соответствующие пептиды К3HHH и К3HNH получены. Спроектированы мутантные кэпирующие пептиды на основе бета-2-микроглобулина: мутации некоторых аминокислотных остатков на пролин сделаны с тем, чтобы нарушить соответствующие водородные связи и остановить рост фибриллы в сторону ее либо «+», либо «-» конца. С той же целью спроектированы искусственные белки для кэпирования амилоидной фибриллы. В этих белках описанные выше кэпирующие пептиды соединены специально сконструированными петлями в единый белок. Показано, что полный объём конформационного пространства белковой молекулы на много порядков меньше на уровне формирования и упаковки элементов вторичной структуры, чем на уровне конформаций аминокислотных остатков. Это делает время перебора разных вариантов укладки цепи «биологически-разумным». Показано также, что биоинформатические методы оценки скорости сворачивания белков (в отличие от предложенной нами ранее физической теории) не выдерживают проверки возрастающим экспериментальным материалом. Таким образом, мы завершили теоретическое исследование перехода через свободно-энергетический барьер, разделяющий нативное и денатурированное (развернутое) состояния белка: если наша ранняя теория базировалась, в основном, на переходе из нативного в развернутое состояние, то теперь мы рассмотрели переход из развернутого состояния в нативное. Критический анализ экспериментальных данных, приведенных в только что вышедшей статье Libich’a и др. [PNAS, 112:8817, 2015], свидетельствуют что (вопреки мнению авторов этой статьи!) шаперонин GroEL замедляет [Marchenko et al., PNAS, 112, Early Edition, November 24, 2015] суммарный процесс сворачивания белка (хотя он и ускоряет одну из его стадий). Это бросает вызов широко распространенной догме, что шаперонины - катализаторы сворачивания/разворачивания белков. Объектами нашего изучения амилоидогенных пептидов были: А-бета 1-40 пептид и К3 пептид бета-2-микроглобулина. Целью работы было придание данным пептидам свойств, необходимых как для кэпирования амилоидных фибрилл, так и для изменения условий их образования. Для этого в их последовательности были введены аминокислотные замены. Для мутантов А-бета пептида, А-бета-3Pro и А-бета-4Pro, необходимым свойством была способность ингибировать образование амилоидных фибрилл А-бета пептидом дикого типа, кэпируя «+» и «–» концы фибриллы. Опытом показано, что сконструированные пептиды способны снижать эффективность амилоидообразования при добавлении к пептиду дикого типа. Целью инженерии мутанта К3HHH К3 пептида бета-2-микроглобулина являлось определение роли распределения заряженных аминокислот в К3 пептиде. Введение замен D15H, E17Н и D19H позволило изменить область рН-чувствительности амилоидной агрегации. Амилоидная агрегация К3 пептида дикого типа происходит при рН 2.5 а при рН 7.5 его фибриллы распадаются. Полученный же мутант образует амилоидные агрегаты при рН 7.5, а при рН ниже 6 амилоидной агрегации не происходит. Таким образом, показана принципиальная возможность целенаправленной инженерии амилоидообразующих пептидов. На трех белках (апомиоглобин, зеленый флуоресцентный белок и белок GalphaO) показана и подтверждена экспериментально возможность направленным мутагенезом выборочно влиять на разные промежуточные и переходные состояния глобулярных белков. Для N-концевого домена белка H2KD показана возможность использования его в качестве белка, связывающего амилоидообразующие пептиды Получены и экспрессированы в клетках E. coli генетические конструкции, кодирующие гены молекулярного шаперона GroEL дикого типа и слитых белков GroEL-GFP и GroEL-люцифераза. Показано, что практически 100%-ная сборка in vivo (в клетках E. coli) тетрадекамерной частицы из слитых белков GroEL-фотобелок (GFP или люцифераза) и GroEL дикого типа происходит при ко-экспрессии генов этих белков с различной копийностью (копийность гена GroEL-фотобелок должна быть на порядок ниже копийности гена GroEL дикого типа). Исследовано равновесное разворачивание гексамерного белка HFQ гуанидин гидрохлоридом и понижением pH. Показано, что разрушение структуры белка HFQ происходит с образованием промежуточного состояния (частично развернутого мономера при действии гуанидин гидрохлоридом или тримера при действии низких pH); заселённость этого состояния увеличивается с понижением концентрации белка. Проанализированы лизаты различных клеток с использованием аффинных носителей на основе денатурированных пепсина и лизоцима. Показано, что при этом GroEL-подобные шапероны можно выделить в одну стадию. Синтезированы, выделены и охарактеризованны пять вариантов апомиоглобина. Для трех из них (дикий тип, V10F и V10A мутанты) определены участки полипептидной цепи, формирующие остов амилоидных фибрилл.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
На основе собранной нами базы данных http://phys.protres.ru/~sergey/loops_database/ по наблюдающимся в белках петлям, спроектированы оптимальные петли для нескольких вариантов объединения нескольких амилоидогенных К3 пептидов в единый белок, способный кэпировать амилоидную фибриллу. В итоге спроектировано много вариантов последовательностей искусственных белков (и соответствующие им генетические конструкции), предназначенных для кэпирования каждого из двух концов фибриллы из К3 пептидов, причем среди них есть последовательности, предназначенные для как правозакрученной, так и левозакрученной структуры белка. Исследована кинетика амилоидной агрегации А-бета пептида в присутствии различных количеств мутантных пептидов 3Pro и 4Pro. Показано концентрационно-зависимое ингибирование пептидами 3Pro и 4Pro амилоидообразования А-бета пептида дикого типа, и не выявлено их амилоид-инициирующей активности в исследованных условиях. Методом переноса флуоресцентной энергии и флуоресцентной конфокальной микроскопии было показано значительное влияние поверхности стекла на агрегацию А-бета пептида, меченного флуоресцентными красителями Су3 и Су5. Была выявлена сорбция пептидов на поверхности стекла и взаимодействие пептидов на ней. При этом, в толще раствора взаимодействия между мечеными пептидами в исследуемых условиях не были выявлены. Данные результаты могут указывать на поверхности раздела фаз как на место инициации амилоидных фибрилл. Было показано, что К3 пептиды дикого типа и его мутантные формы с противоположным зарядом не образуют совместных амилоидных агрегатов, как то предполагалось ранее. С целью получения глобул на основе К3 пептида, были полученные конструкции несущие последовательности, соответствующие спроектированным ранее структурам из трёх повторов К3 пептида, соединённых петлями. (см. наш Отчет РНФ за 2015 г.). Целевой «белок из трех повторов» был соединён линкером с белком-носителем (тиоредоксином). Была проведена наработка и выделение гибридного белка, несущего вариант такой «тримерной» конструкции - вариант, еще не имеющий пролиновых остатков, предназначенных (см. наш Отчет РНФ за 2015 г.) для ингибирования амилоидной агрегации. Показано, что полученный гибридный белок имеет повышенную способность к амилоидной и неамилоидной агрегации, что затрудняет его выделение. Выделены и очищены четыре варианта белков, состоящих из N-домена белка H2KD, линкера и целевого амилоидогенного пептида. В результате показано, что N-домен H2KD мало пригоден для специфического связывания амилоидных структур, т.е. он не годится на роль кэпирующего амилоидную фибриллу белка. Исследованы мутантные формы зеленого флуоресцентного белка (GFP) с рядом замен аминокислот в позициях 59, 62, 63, 14, 112 и введенными цистеиновыми мостиками V11C-D36C и V93C-Q111C. Показано, что (а) изоформы GFP по-разному связывают растворитель внутри этого белка; (б) одиночные замены аминокислот не влияют на гидратированность переходного состояния GFP при его тепловой денатурации; (в) что введение цистеинового мостика V93C-Q111C меняет скачек теплоемкости при тепловой денатурации на 9 кДж/Моль*К, что, видимо, связано с изменением гидратированности одного из переходных состояний этого белка. Спроектирован и исследован мутантный белок Gαo с увеличенной термостабильностью. Показано, на примере карбоксиангидразы, что замены аминокислот с большим количеством контактов не влияют на скорости ее сворачивания. Спроектировано и исследовано восемнадцать мутантных форм апомиоглобина. Показано, что одиночные замены его аминокислот не могут сильно изменить стабильность промежуточного состояния типа расплавленной глобулы относительно развернутого, что введение S-S мостика стабилизирует это состояние, что аминокислотные замены на поверхности белка могут стабилизовать его структуру, и что и что мутациями петель можно повлиять на переходное состояние белка. В результате исследований сворачивания и сборки олигомерных структур молекулярных шаперонов - тетрадекамерного GroEL, гептамерного GroES и гексамерного HFQ установлено, что специфическая олигомеризация этих белков происходит с участием «не полностью свёрнутых» субъединиц, окончательное сворачивание и стабилизация которых происходит уже в составе олигомера. Показано также, что в сложные олигомерые белковые структуры in vivo можно включать маркерные белки достаточно большого размера (до 30 кДа) без существенного нарушения структур и основных функций олигомерных белков. Наряду с этим, показано, что GroEL (14-субъединичный шаперон), содержащий 1-2 слитые с GFP субъединицы, способствует формированию гигантских неразделённых клеточных образований. Полученные результаты могут быть использованы в инженерии олигомерных белковых структур (включая молекулярные «машины») и в разработке на их основе новых лекарственных препаратов. Методом ограниченного протеолиза с последующей тандемной масс-спектрометрией нам удалось определить участки полипептидной цепи миоглобина, формирующие остов амилоидных структур. Показано, что основными структурными элементами формирования остова амилоидных фибрилл в миоглобине и его мутантных формах (V10A, V10F, M131A, M131W, V10AM131A, W14A, W14F, L115A) являются участки с 1 по 27, с 60 по 90, с 97 по 124 и с 134 по 154 аминокислотный остаток (в то время как после протеолиза мономерного апомиоглобина в растворе отсутствуют крупные пептиды). Показано, что белок дикого типа и мутантные формы апомиоглобина, содержащие одиночные мутации, формируют амилоидный остов, используя какие-либо три из четырех перечисленных выше участков аминокислотной последовательности. Однако двойной мутантный белок V10AM131A содержит все четыре участка. Таким образом, методами масс-спектрометрии и ограниченного протеолиза нами показана возможность изменения структуры амилоидного остова в зависимости от мутаций в полипептидной цепи. Издана книга: Finkelstein A.V., Ptitsyn O.B. Protein Physics. A Course of Lectures, 2nd Edition. (Academic Press, 2016), суммирующая, в частности, многолетние исследования ее авторов.