Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Проведены эксперименты, направленные на изучение роли макроукладки хроматиновой фибриллы в организации активных хроматиновых компартментов. С использованием техники фиксации конформации хромосомы (3С) продемонстрировано, что помещение изолированных ядер эритроидных клеток мыши в гипотонический раствор, приводящее к декомпактизации хроматина и разрушению ядерных компартментов (тельца Кахаля, PML-тельца), сопровождается утратой пространственных ассоциаций между удаленными регуляторными элементами домена бета-глобиновых генов. Иначе говоря, продемонстрировано, что декомпактизация хроматиновой фибриллы сопровождается дезинтеграцией акиваторного хроматинового компартмента домена бета-глобиновых генов. С использованием того же экспериментального подхода (3С) продемонстрировано, что активаторный хроматиновый компартмент домена бета-глобиновых генов восстанавливается при повышении уровня макромолекулярного скопления, которое обеспечивали путем добавления полиэтиленгликоля к суспензии ядер в гипотоническом растворе. Учитывая то обстоятельство, что при добавлении агента, повышающего уровень макромолекулярного скопления, происходит восстановление исходного уровня конденсации хроматина, можно утверждать, что способ макроукладки хроматиновой фибриллы играет ключевую роль в обеспечении взаимного пространственного позиционирования регуляторных элементов, контролирующих экспрессию бета-глобиновых генов. С использованием процедуры 5С (протокол, базирующийся на технике фиксации конформации хромосомы, но позволяющий одновременно изучать уровень пространственной сближенности большого числа геномных элементов) изучена пространственная организация протяженного (2500 т.п.н.) сегмента хромосомы 14 кур, включающего домен альфа-глобиновых генов, в лимфоидных клетках, пролиферирующих эритроидных клетках и дифференцированых эритроидных клетках, экспрессирующих глобиновые гены. Продемонстрировано, что активация транскрипции глобиновых генов коррелирует с декомпактизацией топологически-ассоциированного домена, в границах которого находится кластер альфа-глобиновых генов. В части проекта, посвященной изучению доменной организации генома, проведено два цикла экспериментов, направленных на получение ответа на вопрос о том, сопровождается ли функциональная сегрегация доменов слитых α/β-глобиновых генов Danio rerio структурным обособлением стадиеспецифичных субдоменов. Изучена чувствительность к обработке ДНКазой I различных сегментов главного локуса глобиновых генов, который расположен на хромосоме 3 и содержит 13 α- и β-глобиновых генов, экспрессирующихся на “эмбрионально-личиночной” и “взрослой” стадиях развития организма. В качестве экспериментального объекта были использованы культивируемые фибробласты Danio rerio (ATCC №CRL-2298), в которых глобиновые гены заведомо не экспрессируются. Эксперименты проводили согласно стандартному протоколу, включающему обработку пермеабилизованных клеток возрастающими количествами ДНКазы I и последующий анализ представленности в полученных препаратах ДНК полноразмерных рестриктных фрагментов из анализируемых геномных областей. На основании сравнения динамики исчезновения полноразмерных рестриктных фрагментов по мере углубления нуклеазного гидролиза сделано заключение о том, что наибольшей чувствительностью к ДНКазе I отличается эмбрионально-личиночный сегмент домена. Соответственно, можно утверждать, что организация в хроматиновые структуры слитого домена α/β – глобиновых генов Danio rerio не является единообразной на протяжении всего домена даже в тех клетках, где глобиновые гены не экспрессируются. Результаты дополнительно проведенных экспериментов по анализу профилей модификаций гистонов в домене α/β – глобиновых генов Danio rerio позволяют полагать, что разная чувствительность “эмбрионально-личиночного” и “взрослого” субдоменов к перевариванию ДНКазой I в ядрах фибробластов является следствием предпочтительного привлечения репрессорного комплекса PRC1 к “взрослому” субдомену. Мы продемонстрировали, что распределение ассоциированной с репрессией комплексами PRC1/PRC2 посттрансляционной модификации гистона H3 (триметилирование Н3 по лизину 27) в границах домена не является равномерным. Триметилированный по позиции К27 гистон H3 предпочтительно представлен в субдомене, содержащем “взрослые” глобиновые гены. Наиболее убедительно наличие структурных субдоменов в главном локусе глобиновых генов Danio rerio продемонстрировано в экспериментах с эритроидными клетками. Проведенный с использованием техники иммунопреципитации хроматина анализ профилей распределения модифицированных гистонов показал, что в эмбриональных эритроцитах хроматин эмбрионально-личиночного субдомена главного локуса α/β – глобиновых генов обогащен активирующими модификациями гистонов (панацетилированные гистоны Н3 и H4), тогда как неактивные гены взрослого субдомена обогащены ассоциированной с репрессией комплексaми PRC1/PRC2 модификацией гистона H3 (H3K27me3). После начала экспрессии глобинов взрослого типа распределение модифицированных форм гистонов зеркально изменяется: активирующие модификации гистонов картируются в той части домена, где находятся «взрослые» гены, тогда как репрессирующие модификации картируются в эмбриональной и эмбрионально-личиночной частях домена. Таким образом, стадиеспецифичная активация и репрессия глобиновых генов в эритроидных клетках Danio rerio реализуется в контексте двух выраженных структурных (хроматиновых) субдоменов. Характер распределения модифицированных форм гистонов в главном локусе позволяет предполагать наличие специализированного геномного элемента, расположенного между субдоменами. Возможная функция этого регуляторного элемента состоит в стадиеспецифичном ограничении действия энхансера, а также в ограничении распространения как активирующих, так и репрессирующих модификаций гистонов на разных стадия развития. Наряду с главным локусом глобиновых генов в геноме Danio rerio присутствует также минорный локус глобиновых генов. Этот локус расположен на хромосоме 12 и содержит 4 глобиновых гена, два из которых экспрессируются на эмбриональной стадии и два – на личиночной стадии. Генов, экспрессирующихся в кроветворных тканях взрослого организма, в этом локусе нет. Мы провели анализ данного локуса с использованием тех же подходов, которые использовались при анализе главного локуса глобиновых генов. Существенного различия в чувствительности к ДНКазе I между генами эмбрионального и личиночного субдоменов выявлено не было. Активирующие и репрессирующие модификации гистонов оказались равномерно распределены на протяжении всего локуса. На основании этих результатов сделано заключение о том, что в минорном локусе глобиновых генов Danio rerio функциональная сегрегация домена на эмбриональный и личиночный субдомены не сопровождается структурным обособлением субдоменов. В части проекта, посвященной изучению механизмов, обеспечивающих защиту генома в условиях теплового и репликативного стрессов был охарактеризован полный спектр транскриптов, экспрессия которых активируется, либо подавляется в условиях теплового стресса. Проведен RNAseq-анализ транскриптома клеток HeLa, подвергнутых тепловому стрессу. Обнаружено более 300 дифференциально экспрессирующихся в условиях теплового стресса генов. Идентифицированы не изученные ранее микроРНК, экспрессия которых увеличивается в 70-99 раз в ответ на тепловой стресс. Продемонстрировано, что при тепловом стрессе понижается уровень экспрессии значительного числа генов, продукты которых участвуют в регуляции транскрипции, тогда как уровень экспрессии абсолютного большинства генов «домашнего хозяйства» остается неизменным. Проведен анализ динамики посттрансляционных модификаций гистонов в клетках человека, подвергнутых тепловому стрессу. Продемонстрировано, что уровень посттрансляционных модификаций гистонов, характерных для различных типов гетерохроматина, не меняется в результате теплового стресса. Показано, что тепловой стресс приводит к гипоацетилированию гистонов H3 и H4. Обнаружено, что стресс-индуцируемое гипоацетилирования гистонов H3 и H4 в клетках человека со сниженным уровнем экспрессии белка гетерохроматина 1α происходит с задержкой по времени по сравнению с клетками, в которых этот белок экспрессируется на нормальном уровне. Проанализирована универсальность продемонстрированного нами ранее феномена стресс-индуцируемого ареста репликации ДНК и сопутствующего этому фосфорилирования гистона H2AX. Для этого исследованы эффекты теплового стресса на репликацию ДНК раковых клеток человека (HeLa), трансформированных клеток (HEK293) и первичных фибробластов человека. Показано, что максимальные использованные значения теплового стресса (45ºС, 30 мин) приводят к аресту репликации ДНК во всех типах клеток человека. При этом репликативная активность клеток восстанавливается уже через 30 минут после их возвращения в нормальные физиологические условия. С помощью метода двойного иммуноокрашивания аналогов нуклеотидов на нитях ДНК мы продемонстрировали, что восстановление репликации после теплового стресса имеет постепенный характер и происходит, в основном, за счет продолжения работы предсуществовавших репликативных вилок. С помощью ингибиторного анализа и РНК-интерференции показано, что ассоциированное со стресс-индуцируемым арестом репликации фосфорилирование вариантного гистона H2AX в клетках HeLa осуществляется ДНК-зависимой протеинкиназой (DNA-PK). Подавление активности DNA-PK в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла, приводило к тому, что после теплового стресса накапливались двунитевые разрывы ДНК и индуцировался каспаза-3/7-зависимый апоптоз. Те же эффекты наблюдали в отсутсвие ингибирования DNA-PK в клетках со сниженным уровнем экспрессии H2AX. Таким образом, получены убедительные свидетельства того, что фосфорилирование H2AX и образование протяженных доменов γH2AX необходимо для предотвращения коллапса репликации ДНК и обеспечения выживаемости клеток в условиях теплового стресса.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
- Продемонстрировано, что подавление экспрессии (деплеция) гистондеацетилазы HDAC1 приводит к усилению границ топологически-ассоциированных доменов (ТАД) и, как следствие, к более выраженной пространственной сегрегации ТАДов друг от друга. - Продемонстрировано, что повышение уровня ацетилирования хроматина в масштабе всего генома приводит к разрыхлению структуры хроматина на уровне ТАДов и их пространственных агломератов, что подтверждает выдвинутую нами ранее гипотезу о том, что уровень ацетилирования хроматина может напрямую влиять на степень компактизации генома. - Продемонстрировано, что белок Chriz не играет ключевой роли в поддержании границ топологических доменов в интерфазных хромосомах Drosophila melanogaster. Анализ топологии генома клеток Drosophila melanogaster на фоне деплеции белка Chriz показал, что обеднение по этому белку не приводит к значительному изменению силы границ ТАДов. - Идентифицированы регуляторные элементы главного локуса глобиновых генов Danio rerio и охарактеризована пространственная структура этого локуса в эритроидных клетках эмбрионального и взрослого типов. Продемонстрировано, что транскрипция глобиновых генов эмбрионального типа не требует привлечения к эмбриональной части главного локуса α/β-глобиновых генов консервативного эритроид-специфичного энхансера, расположенного перед локусом. - Раскрыты причины исключительно высокой чувствительности к генотоксическим стрессам клеток, находящихся на стадии ранней S-фазы. Продемонстрировано, что действие теплового стресса на клетки, находящиеся в S-фазе клеточного цикла, является комплексным: помимо кратковременного ареста репликации ДНК, тепловой стресс приводит к немедленному образованию одноцепочечных разрывов ДНК, а также к отсроченному образованию двуцепочечных разрывов ДНК. Причиной возникновения одноцепочечных разрывов ДНК при тепловом стрессе является индуцированное тепловым стрессом подавление активности ДНК-топоизомеразы I. В последующем одноцепочечные разрывы ДНК конвертируются в двуцепочечные разрывы в ходе процесса репликации ДНК. - Продемонстрировано, что образование двуцепочечных разрывов ДНК при тепловом стрессе клеток, находящихся в G1- и G2-фазах клеточного цикла, происходит в результате ингибирования активности бета-изоформы ДНК-топоизомеразы II.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
- Проанализированы профили разделения хромосом дрозофилы на топологически ассоциированные домены в культивируемых клетках, обработанных ингибитором гистондеацетилаз трихостатином А. Показано, что гиперацетилирование гистонов, происходящее в условиях подавления активности гистондеацетилаз приводит к компактизации ТАДов, падению частоты контактов между ними и к увеличению силы границ ТАДов. - Проанализировано влияние подавления экспрессии ДНК-связывающего белка Putzig на профили разделения хромосом дрозофилы на топологически ассоциированные домены. Показано, что белок Putzig, формирующий комплекс с Chriz и киназой JIL-1, и обогащённый в интер-ТАДах, не играет ключевой роли в установлении и поддержании границ ТАДов. - С использованием техники 5С, основанной на кросс-лигировании близкорасположенных фрагментов ДНК, изучено влияние активации транскрипции семенник-специфичных генов на пространственную организацию протяженных сегментов генома, в границах которых расположены данные гены Показано, что массивная активация семенник-специфичных генов в процессе сперматогенеза Drosophila melanogaster не приводит к значительной декомпактизации ТАДов, содержащих эти гены, и возникновению новых границ ТАДов. Вместе с тем, в мужских герминальных клетках (по сравнению с культивируемыми соматическими клетками) выявлена повышенная частота контактов на малых и средних геномных расстояниях, что свидетельствует о начале процессов компактизации хроматина в ходе дифференцировки этих клеток в зрелые сперматозоиды. - Охарактеризованы пространственная организация главного локуса α/β -глобиновых генов Danio rerio и профили ацетилирования гистонов в границах данного локуса в эритроцитах личинок и взрослых рыб Danio rerio. Показано, что эмбрионально-личиночный и «взрослый» сублокусы главного локуса глобиновых генов сегрегированы на уровне организации в хроматиновые домены и на уровне пространственной организации в ядре. Также показано, что эти сублокусы функционально изолированы. В частности, продемонстрировано, что лишь сублокус, содержащий глобиновые гены взрослого типа, регулируется консервативным эритроид-специфичным энхансером, находящимся перед главным локусом α/β -глобиновых генов. Идентифицирован CTCF-зависимый инсулятор, обеспечивающий функциональную изоляцию сублокусов главного локуса глобиновых генов Danio rerio. - Охарактеризованы промоторы генов минорного локуса α/β -глобиновых генов Danio rterio. Охарактеризованы уровни активации этих промоторов энхансером, расположенным перед локусом. - Всесторонне охарактеризована модельная система выбранная нами для исследования не связанного с разрывами ДНК фосфорилирования гистона H2AX – механический стресс, который заключался в кратковременной инкубации клеток в гипотоническом растворе. Продемонстрировано, что гипотонический стресс индуцирует фосфорилирование H2AX (образование γH2AX), которое не связано с образованием повреждений ДНК. С помощью РНК-интерференции и ингибиторного анализа показано, что киназой, ответственной за фосфорилирование H2AX при гипотоническом стрессе, является ATM. - С использованием электронной и флуоресцентной микроскопии продемонстрировано, что “мягкий” гипотонический стресс приводит к масштабным изменениям структуры хроматина, которые, тем не менее, являются обратимыми. Одновременно показано, что в условиях гипотонического стресса происходит остановка репликации и транскрипции ДНК. - Разработана оптогенетически управляемая система индукции преждевременного клеточного старения. Эта система основана на индукции одно- и/или двухцепочечных разрывов ДНК в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла, с помощью активируемых светом токсичных флуоресцентных белков (фотосенсибилизаторов) tKR и miniSOG, таргетированных в хроматин. Впервые показано, что генетически-кодируемые фотосенсибилизаторы, направленные в хроматин, могут, в случае активации, вызывать образование разрывов ДНК. - Разработан алгоритм анализа изображений на основе бесплатного программного обеспечения с открытым кодом CellProfiler, позволяющий в автоматическом режиме анализировать большие объемы препаратов ДНК-комет. Разработан протокол модифицированного метода ДНК-комет и соответствующий алгоритм анализа изображений на основе CellProfiler, позволяющие анализировать повреждения ДНК с учетом стадии клеточного цикла. Разработанный подход был верифицирован: было показано, что его использование существенно увеличивает общую чувствительность метода ДНК-комет