Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В ходе выполнения проекта впервые выявлены условия, оптимальные для получения выживающих (покоящихся) форм грамположительных неспорообразующих бактерий Arthrobacter agilis Lush13, Gordonia polyisoprenivorans 135, и Microbacterium sp. B51. Оптимизированы условия для получения покоящихся форм штамма Rhodococcus opacus 1CP, что выражалось в большем числе крупных цистоподобных клеток. Основными приемами для получения выживающих клеток были: (1) длительная инкубация (до 4 мес) культур, выращенных на богатой среде (LB-бульоне); (2) инкубация (1-4 мес) культур на модифицированной среде СР1 с лимитом источника азота; (3) имитация стресса голодания при перенесении клеток культур ранней стационарной фазы в физраствор с СаСl2 (0.2 г/л); (4) воздействие химического аналогаауторегуляторов клеточной дифференцировки С12-АОБ. Для образования покоящихся форм с длительной сохранностью жизнеспособности у всех исследуемых актинобактерий было развитие на среде с азотной лимитацией (сохранение титра КОЕ в пределах того же порядка при инкубации 1- 4 мес). Выявлен высокий потенциал микробактерий к выживанию в различных трофических условиях, в том числе, в условиях множественного голодания. На основании проведенных исследований рекомендованы простые и воспроизводимые методы для получения покоящихся (выживающих) клеток для дальнейшего исследования их биодеградативного потенциала. Сравнительный морфологический и морфометрический анализ показал, что в прорастающей вегетативной культуре клеток R. opacus 1CP на этапе 1-2 пассажей культивирования присутствует большое количество (до 30%), покоящихся цистоподобных клеток, которые способны к дроблению с сохранением рефрактерности, но не к прорастанию. Эти клетки не давали начала микроколониям и не формировали характерные (по плотности) выросты, которые типичны для вегетативных клеток. Показано, что популяция ЦПК R. opacus шт. 1CP в значительной степени гетерогенна по прорастанию. В первые 2 часа культивирования только ~0,2% клеток начинали активно делиться и формировать микроколонии. Около 20% ЦПК находились в стадии выхода из покоя (снижение рефрактерности клеток, появление и увеличение в длину характерных выростов из ЦПК сферической и овоидной формы и т.п.). В интервале 5-7 часов культивирования число вегетирующих клеток в первом пассаже возрастало до 45-50%, а во втором пассаже достигало 70%. Быстро растущие колонии проросших в первые часы культивирования клеток захватывали в себя оставшиеся рефрактерные ПК, которые прорастали при последующих пересевах. Эта особенность штамма 1СР значительно затрудняла точную количественную оценку. Изучена способность вегетативных культур представителей четырех родов актинобактерий (Arthrobacter, Microbacterium, Rhodococcus, Gordonia) разлагать бензойную кислоту и ее аналоги, содержащие в ароматическом кольце гидроксильные группы или хлор. Показано, что для большинства проверенных штаммов субстратами служили бензоат, 3-хлорбензоат и 4-гидроксибензоат. Определены максимальная удельная скорость роста и время удвоения бактерий при росте на данных субстратах. Впервые полно, с использованием 16 соединений, изучена субстратная специфичность бензоат диоксигеназ (БДО) актинобактерий. Установлено, что она варьировала от узкой у штаммов Rhodococcus opacus 1CP и Gordonia polyisoprenivorans 135 до широкой у Rhodococcus ruber P25 и Microbacterium sp. B51. У выделенных из территориально-удаленных сайтов штаммов R. opacus 1CP, Rhodococcus opacus 6a, Rhodococcus ruber P25, Rhodococcus wratislaviensis P1 и Rhodococcus wratislaviensis G10 выявлены гены, кодирующие α-субъединицу БДО со сходством, составляющим от 88 до 97% с БДО штамма Rhodococcus jostii RHA1, что указывает на общее происхождение этих генов. Определение активности ферментов периферийного метаболизма, индуцирующихся при росте актинобактерий на бензоате, позволило впервые зафиксировать одновременную индукцию пирокатехин 1,2-диоксигеназы и гентизат диоксигеназы в клетках бактерий, выращенных на бензоате.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Получены покоящиеся формы клеток (ПК) актинобактерий трех родов: Arthrobacter, Gordonia и Microbacterium, изучены особенности их морфологии и ультраструктурной организации. Покоящиеся формы клеток Arthrobacter agilis Lush13 представлены преимущественно многоклеточными конгломератами плотно упакованных клеток с резко выраженным различием по форме и размеру (объему), в том числе ультрамелких клеточных форм Покоящиеся формы клеток Microbacterium sp. B51 представлены преимущественно единичными мелкими и ультрамелкими клетками, отличающимися высокой плотностью цитоплазмы, компактизованым нуклеоидом и плотной клеточной стенкой с внешним дополнительным покровом в виде рыхлого гранулярного слоя Переход к вегетативному росту ПК Arthrobacter Lush13 сопровождается распадом конгломератов на единичные клетки, постепенным изменением структуры цитоплазмы и ее уплотнением с последующим активным ростом и делением клеток и одновременным формированием плотного внеклеточного и межклеточного фибриллярного матрикса-«кокона». Переход к вегетативному росту ПК Microbacterium sp. B51 сопровождается формированием крупных клеточных форм - полиплоидов, объем цитоплазмы и нуклеоплазмы которых ~ в 40 раз превышает объемы вегетативных клеток, последующим разделением нуклеоплазмы на дискретные нуклеоиды и множественным дроблением крупных клеток на ультрамелкие «мононуклеоидные» клеточные формы (объемом 0,01 – 0,02 мкм3). Изучена способность представителей четырех родов актинобактерий (Arthrobacter, Microbacterium, Rhodococcus, Gordonia) разлагать бензойную кислоту и ее аналоги, содержащие в ароматическом кольце гидроксильные группы или хлор. Показано, что для большинства проверенных штаммов субстратами служили бензоат, 3-хлорбензоат и 4-гидроксибензоат. Определены максимальная удельная скорость роста и время удвоения бактерий при росте на данных субстратах. Впервые полно, с использованием 16 соединений, изучена субстратная специфичность бензоат диоксигеназ (БДО) актинобактерий. Установлено, что она варьировала от узкой у штаммов Rhodococcus opacus 1CP и Gordonia polyisoprenivorans 135 до широкой у Rhodococcus ruber P25 и Microbacterium sp. B51. У выделенных из территориально-удаленных сайтов штаммов R. opacus 1CP, Rhodococcus opacus 6a, Rhodococcus ruber P25, Rhodococcus wratislaviensis P1 и Rhodococcus wratislaviensis G10 выявлены гены, кодирующие α-субъединицу БДО со сходством, составляющим от 88 до 97% с БДО штамма Rhodococcus jostii RHA1, что указывает на общее происхождение этих генов. Определение активности ферментов периферийного метаболизма, индуцирующихся при росте актинобактерий на бензоате, позволило впервые зафиксировать одновременную индукцию пирокатехин 1,2-диоксигеназы и гентизат диоксигеназы в клетках бактерий, выращенных на бензоате. Изучены особенности процесса разложения бензоата бактерией R. opacus 1CP после состояния покоя. Ростовые показатели указывают, что критичной для разложения данного соединения является концентрация в 0.5 г/л. Дальнейшее повышение концентрации до 10 г/л сопровождается снижением максимальной дельной скорости роста, увеличением времени удвоения клеток и снижением удельной активности диоксигеназ в бесклеточном экстракте. Три диоксигеназы определяют процесс деструкции бензоата штаммом R. opacus 1CP. Анализ активности БДО с изомерными хлор-, гидрокси- и метилзамещенными бензоатами не позволил выявить соединения, активность с которыми БДО была бы сравнима с активностью с бензоатом. Только некоторые субстратные аналоги (3- и 4-хлорбензоаты) выступали в качестве ингибиторов реакции БДО с бензоатом. Определение субстратной специфичности БДО с бензоатом позволило определить значение кажущейся константы связывания БДО. Тип кривой титрования данного фермента субстратом указывает на аллостерическую регуляцию активности фермента и свидетельствует о положительной кооперации по субстрату. Обнаружена интересная особенность в индукции пирокатехин диоксигеназы, отвечающей за раскрытие ароматического кольца у штамма 1CP после состояния покоя. Она характеризовалась широкой субстратной специфичностью и отличалась от ПК 1,2-ДО из этого штамма, выделенной ранее из клеток, выращенных на бензоате. По субстратной специфичности описываемая ПК 1,2-ДО была близка к ПК 1,2-ДО из штамма 1СР, выращенного на 4-метилбензоате. Ранее при исследовании биодеградативного потенциала культуры R. opacus 1CP после состояния покоя было обнаруженр, что возобновление роста покоящихся клеток сопровождалось расширением их способности утилизировать трудноразлагаемые соединения. Это выражалось как в сокращении лаг-фазы при культивировании на хлорфенолах, так и в расширении спектра субстратов, которые ранее или не утилизировались культурой или на их разложение требовалось длительное время. Закономерно возник вопрос, какие системы отвечают за новые/улучшенные свойства штамма как эффективного биодеструктора. На данном этапе исследований мы показали, что адаптивные возможности культуры определяются скорее всего теми ферментными системами, которые есть в клетке. Например, состояние покоя не способствовало изменению активности БДО у R. opacus 1CP, которая у данного штамма является чрезвычайно узко-специфичным ферментом. Напротив, феномен индукции ПК 1,2-ДО, отличной от обнаруженной в клетках, выращенных на бензоате, показывает, что штамм может активировать различные ферментные системы для возобновления роста. Таким образом, можно предположить, что механизмы индукции ферментов определяются не только субстратом, но и физиологическим состоянием культуры.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Изучены диоксигеназы, индуцирующиеся при разложении бензоата у актинобактерии Rhodococcus wratislaviensis G10, деструктора (галоген)ароматических соединений. R. wratislaviensis G10 полностью разлагал 2 г/л бензоата за 30 ч, 10 г/л – за 200 ч. Отмытые клетки, выращенные на бензоате, сохраняли дыхательную активность более 90 сут, высокую активность бензоатдиоксигеназы – до 10 сут. С 13 из 35 субстратных аналогов активность бензоатдиоксигеназы составляла 10–30% от уровня активности с бензоатом. Выделены и охарактеризованы две диоксигеназы, расщепляющие ароматическое кольцо, – протокатехоат-3,4-диоксигеназа и пирокатехин-1,2-диоксигеназа. Пирокатехин ингибировал активность протокатехоат-3,4-диоксигеназы. Не обнаружено ингибирующего воздействия протокатехоата на активность пирокатехин-1,2-диоксигеназы. Методом времяпролетной MALDI-TOF-масс-спектрометрии показана высокая идентичность белковых профилей клеток R. wratislaviensis G10 и Rhodococcus opacus 1CP – высокоактивного деструктора ароматических поллютантов, выращенных на бензоате или богатой среде. Проведена специфическая амплификация ДНК штамма R. wratislaviensis G10 с использованием специфичных праймеров к вариабельным участкам генов, кодирующих α- и β-субъединицы протокатехоат-3,4-диоксигеназы, и к двум генам штамма R. opacus 1CP, кодирующим пирокатехин-1,2-диоксигеназы. Сходство полученных продуктов с соответствующими участками генов R. opacus 1CP составило 99%. Обнаруженное высокое сходство генов (99%) деградации ароматических соединений у R. opacus 1CP и R. wratislaviensis G10, выделенных из образцов почв, удаленных друг от друга по расстоянию (1400 км) и времени выделения микроорганизмов (20 лет), свидетельствует об общем происхождении генов биодеструкции и их широком распространении среди родококков. Проведен анализ диоксигеназ, индуцирующихся при разложении бензоата, после возобновления роста культуры Rhodococcus opacus 1CP, длительное, более 5 лет, время находящейся в состоянии покоя. С учетом расширенного списка типов ингибирования, используя целые клетки, выращенные на бензоате, оценена кинетика взаимодействия бензоат 1,2-диоксигеназы (БДО) с хлор-, метил-, гидрокси- моно и ди-замещенными бензоатами. Определен тип ингибирования и рассчитаны константы реакции БДО с бензоатом в присутствии 2-хлорбензоата (2ХБК), 3,5-дихлорбензоата (3,5ДХБК) и 3-метилбензоата (3МБК). Для 2-хлорбензоата тип ингибирования был определен как двухпараметрически рассогласованное ингибирование, а для 3-метилбензоата - воздействие переходного типа: от активации к ингибированию. С помощью метода векторных представлений ферментативных реакций оценен процесс псевдоингибирования реакции БДО с бензоатом в присутствии 3,5-дихлорбензоата. Из клеток, выращенных при низкой концентрации бензоата (до 250 мг/л), выделены две диоксигеназы, расщепляющие ароматическое кольцо – пирокатехин 1,2-диоксигеназа (ПК 1,2-ДО) и протокатехоат 3,4-диоксигеназа (ПКК 3,4-ДО). Показано, что удельная активность этих ферментов в бесклеточном экстракте была на порядок выше, чем при росте данного штамма на более высокой (6 г/л) концентрации бензоата. Однако очищенные ферменты по каталитическим свойствам не отличались от диоксгеназ, выделеных из биомассы, выращенной при высокой концентрации субстрата. Изучены особенности клеточной организации цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) неспорообразующей гетеротрофной актинобактерии, идентифицированной как Microbacterium foliorum BN52, выделенной из почв, загрязненных отходами химических предприятий г. Березняки (Пермский край). ЦПК получены в лабораторных условиях в голодающих культурах. Выявлены и детально охарактеризованы два морфотипа ЦПК, способных ревертировать к вегетативному росту. Впервые изучены морфологические, ультраструктурные и физиологические особенности прорастания и перехода из состояния покоя к вегетативному росту покоящихся форм бактерии M. foliorum BN52. Прорастание ЦПК II морфотипа сопряжено с постепенным восстановлением формы клеток и субклеточных структур. Обнаружено, что в отличие от прорастания ЦПК II морфотипа в первые часы прорастания ЦПК I морфотипа их выход из покоя сопровождается значительным увеличением объёма с последующим формированием очень крупных клеток, размеры которых в несколько раз превышают размеры, типичные для вегетативных клеток этого штамма. Образующиеся клетки характеризуются полинуклеоидностью, представляя собой полиплоиды, которые на следующем этапе прорастания дробятся, что приводит к образованию множественных мелких и ультрамелких жизнеспособных клеточных форм. Предполагается, что процесс формирования цистоподобных покоящихся клеток, прорастающих в виде полиплоидов лежит в основе стратегии выживания и адаптации гетеротрофных бактерий, не способных к деструкции токсикантов, в естественной среде обитания в условиях токсического давления. Изучена ультраструктурная организация экспериментально полученных покоящихся клеток штамма Arthrobacter agilis Lush13 и их переходы между состоянием покоя и прорастанием в вегетативную форму. Переход к вегетативному росту покоящихся клеток сопровождался раскрытием образующихся при входе в покой клеточных конгломератов. A. agilis Lush13 способен к выживанию в присутствии токсичных соединений – хлорфенолов и хлорбензоатов. Культивирование в присутствии неростовых для штамма соединений (хлоробензоатов, хлорфенолов) сопровождается цитологическими изменениями, выражающимися в уменьшении размера клеток и лизисе культуры. В случае использования токсикантов (фенола, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-дихлорфенолов, 2,3,4-, 2,4,5- и 2,4,6-трихлорфенолов и 4-хлорбензоата) в качестве ростового субстрата, длительное, до 3 мес, культивирование сопровождается цитологически видимым переходом клеток в состояние, сходное с состоянием покоя, которое при дальнейшем культивировании сопровождается «улучшением» цитологических характеристик: увеличением размера клеток, снижением количества лизированных клеток, переходом к активному делению клеток и полным потреблением токсичного субстрата. Штамм A. agilis Lush13 способен к росту и разложению нонана, декана и гексадекана, что можно рассматривать как индикатор его способности разлагать нефть. Полученные результаты позволяют рассматривать данные штаммы, M. foliorum BN52 и Arthrobacter agilis Lush13, как модельные при прогнозировании поведения почвенной микрофлоры в условиях токсичного загрязнения и при снижении нагрузки загрязнителей.